重症监护室患者耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌流行病学研究及同源性分析*

周朝琼，邓 劲，刘 翔，孔丽蕊

[1.成都市郫都区中医医院(成都中医药大学附属第三医院)检验科，成都 611730；2.四川大学华西医院实验医学科，成都 610041]

肺炎克雷伯菌作为临床常见和易于分离的条件致病菌，现阶段该菌因其高耐药率、高死亡率、高难度治愈率及高院内感染率等特点被广泛关注[1]。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantklebsiellapneumoniae，CRKP)出现且呈递增趋势的原因是碳青霉烯类抗生素使用不当所致[2]。有研究表明[3-5]医院重症监护室(intensive care unit，ICU)患者因其基础疾病较多故CRKP感染率较高。本研究利用VITEK 2 Compact鉴定系统及细菌分型金标准[脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)[6]]对ICU感染CRKP患者进行流行病学调查，为医院获得性感染、临床用药及减少患者病死率等提供参考依据，现报道如下：

1材料与方法

1.1 研究对象 选取成都市郫都区中医医院2018年1月～2019年1月ICU患者24例，男性16例，女性8例，年龄16～85岁，24例菌株标本类型有：痰(来自下呼吸道)、脑脊液、血液、尿液、尖端导管、腹腔积液及体表浅切口分泌物。

1.2 仪器与试剂 细菌鉴定采用布鲁克公司的基质辅助激光解析飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)，细菌药敏采用梅里埃的全自动细菌生化鉴定药敏分析仪(VITEK 2 Compact)，补充药敏试验纸片购自赛默飞公司，培养和药敏所需的平板购于安图生物有限公司，二氧化碳孵箱采用上海博迅HH.CP-7W，血培养仪为梅里埃公司的全自动血液培养仪Bact Alt 3D，PFGE仪器及配套设备、紫外线透照仪及一次成像照相系统均购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集与接种方法：深部痰标本通过吸痰器采集，尿液采集清洁中段尿，血液采集来自不同穿刺点的外周血或导管血，脑脊液经脑室引流或腰椎穿刺，腹腔积液来自腹腔穿刺液，导管为撤除置管的尖端5 cm，分泌物标本为冲洗后深部采集物。痰液、脑脊液、腹腔积液和分泌物为四区划线，尿液标本为“丰”字型划线，导管尖端为半定量滚动培养，血液为全自动仪器培养。

1.3.2 细菌药敏试验方法：细菌药敏试验采用VITEK 2 Compact进行。针对肺炎克雷伯菌敏感性试验选用的药物为替加环素、多黏菌素B、阿米卡星、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢呋辛、头孢西丁、庆大霉素、复方磺胺甲恶唑、环丙沙星、哌拉西林和氨苄西林/舒巴坦。药敏试验判断参照2018年美国临床实验室标准化委员会(CLSI)制定的标准(https：//clsi.org)。

1.3.3 PFGE方法：PFGE操作步骤依次为细菌准备，胶块制备，细胞裂解，清洗胶块，胶块内DNA的酶切，加样，电泳，图像获取，数据分析，详细步骤参照李秀清等[1]文中PFGE操作方法进行。

1.3.4 菌株同源性判断标准的方法：PFGE结果按TENOVER等[7]的标准判读，如下：①同一克隆型：具有相同条带数目和位置，则为同一菌株。②高度相关：仅有2～3个条带变化，被认为有亲缘关系。③可能相关：通常为4～6个条带变化。④无关：7个及以上条带变化。

1.3.5 院内感染判断标准的方法：病人入院前无明确潜伏期的感染，入院后48 h在医院内获得的感染，包括住院期间获得和在院内获得出院后发生的感染。

2结果

2.1 流行病学结果 24例CRKP菌株中58.33%来自痰(14株)，12.5%来自脑脊液(3株)，血液及尿液各2株，各占8.3%，分泌物、腹腔积液和尖端导管各1例，各占4.2%。24株感染CRKP的患者死亡率为54.2%，出院率为29.2%，转归率为16.7%(死亡：13/24，出院：7/24，转归：4/24)，该菌院内感染率极高，占95.8%(23/24)，外院带入感染者1例，占4.2%(1/24)。

2.2 细菌药敏结果 采用全自动细菌生化鉴定药敏分析仪对24株细菌进行药敏试验，结果显示，仅小于30%的感染者对多黏菌素B敏感，对其余抗生素均100%耐药。

2.3 PFGE结果 按菌株同源性判断标准，24株CRKP的PFGE图谱结果为：1，3，5，6，7，8，11，12，13和14号标本为同一克隆型，2号与10号为同一克隆型，16，17，18和20号为同一克隆型，19，21和23号为同一克隆型。4号、9号与1～3号、5～8号及11～14号菌株间有亲缘关系，15，22和24号三者间也存在亲缘关系，其他菌株基因组间同源性很差或无亲缘关系，应来自于不同克隆菌株，24株CRKP的PFGE图谱见图1。

3讨论

3.1 治疗多重耐药肺炎克雷伯菌的首选药物为碳青霉烯类抗生素，CRKP感染率因临床对该药应用增加不断上升[2，8]，该菌被美国疾病预防控制中心列为目前“最棘手细菌”[9]，有研究报道泛耐药肺炎克雷伯菌(pan-drug resistantKlebsiellapneumoniae，PDRKPN)死亡率高达40%[10]，KARAISKOSL等[11]研究发现CRKP感染引起的死亡率可达23%～75%，感染CRKP的ICU患者院内死亡率增高[12]，本研究24例ICU患者经积极治疗后仍有13例死亡，死亡率高达54.2%，可见该类患者治疗困难，预后较差，死亡率极高[13-14]，有效抗生素的缺乏、较多的基础疾病及免疫力降低均可增加患者死亡率。

3.2 CRKP作为院内感染常见致病菌，2015年中国细菌耐药监测网(China highspeed information network，CHINET)结果显示，其感染率已高达14%[15-16]，有国外报道称其在医院获得性感染中位居第四[17]。医院感染传播途径以空气、接触及媒介为主[18]，LI等[19]对NICU空气环境及其患者病房环境进行研究发现，病房环境可成为CRKP的重要传播途径，同时也可成为潜在的感染源。PFGE因其高分辨率及高重复性，目前被公认为是从基因水平上确定菌株间亲缘关系的细菌分型金标准[6]。本研究PFGE基因分型结果显示，24株CRKP菌株同源性较高，大多数菌株均属同一克隆型，且不为同一克隆型部分菌株间存在亲缘关系，仅少量菌株同源性较差或无亲缘关系，从基因学角度提示院内感染较严重，与实验中对患者是否为院内感染的调查数据相吻合，该结果提示我院需采取有效的院感防控措施，加强医护人员、患者对院内感染的防护及认知，对病房环境及物品严格进行相应消毒及灭菌处理，常开窗保持空气流通，对CRKP感染患者采取一定治疗防护措施，避免引起其他患者或医护人员的感染。

注：M为质控菌株，1～24为1～24号菌株。

3.3 本研究药敏结果显示，临床分离的24株CRKP除30%对多黏菌素B敏感外，对其余抗生素均耐药，符合泛耐药菌株定义[20]，较张丽等[21]研究中耐药率更高，该结果提示我院应进一步规范控制抗生素的使用。CRKP泛耐药导致临床很难找到合适的抗感染治疗方案，患者最终治疗效果与临床所选治疗方案密切相关。临床治疗该类细菌感染可根据药敏结果选用抗生素，以指导临床合理应用抗生素，对其进行耐药监测；同时遵循抗感染治疗的基本原则(经济、安全、有效)，合理选药、合理给药，预防和避免抗生素间的不良反应和相互作用，预防和延缓细菌耐药性的产生，合理用药及治疗可极大提高患者生存率。

3.4 肺炎克雷伯菌主要存在于人体呼吸道及肠道内，当免疫力降低时，可引发肺部相关疾病，如大叶或小叶融合性实变则可因该菌经呼吸道进入肺部而诱发[22]，本研究中CRKP主要分离自痰[23]，表明其主要定植在呼吸道，故应加强感染CRKP可疑患者呼吸道的细菌检测，及时发现CRKP对患者临床治疗及用药指导尤为重要。

3.5 综上所述，我院CRKP菌株同源性较强，耐药率极高，院内感染极为严重，且感染CRKP患者死亡率极高，故应加强并采取有效的院感防护措施，进一步规范抗生素的使用，制定我院CRKP感染的治疗方案和抗生素临床应用策略，减少患者感染率，提高感染患者生存率。