猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法建立应用

徐国翔

（深圳市坪山区动物卫生监督所，广东深圳 518118）

猪瘟是一种烈性传染病，具有高致死性，猪瘟病毒（CSFV）是其主要引发因素，病猪通常会有出血或母猪流产等特征出现。该病传播速度较快，致死率偏高，在传播过程中通常借助呼吸道、消化道，世界动物卫生组织在必须报告的传染病中对猪瘟进行了明确规定。因该病对我国养猪业所造成的危害十分严重，故而农业部也在动物疫病中纳入了该病。

实时荧光RT-PCR是上世纪90年代发展起来的一种能够准确定量核酸分子的新技术，其主要优点是可以对DNA以及机体mRNA表达水平进行定量分析，因此很快应用于病毒学研究[1]，为对猪瘟病毒进行检测，本文通过反复检测试验，成功建立了特异性猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和样品

猪瘟病毒（CSFV）、猪O型口蹄疫病毒（O-FMDV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）的灭活疫苗，购自中牧实业公司，通过多次冻融后用于RNA/DNA提取。

1.1.2 仪器设备与主要试剂

磁珠法全自动核酸提取试剂盒；MagMAXTMExpress核酸提取仪；世纪元亨猪瘟通用型实时荧光RT-PCR试剂盒；ABI7500实时荧光定量PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 模板制备

借助MagMAXTMExpress核酸提取仪，以磁珠法全自动核酸提取试剂盒说明书为根据分别对PPV、PRV、PCV2的DNA和O-FMDV、PRRSV、CSFV的RNA进行提取。将提取的DNA/RNA用于PCR扩增或储存于-20℃处，备用。

1.2.2 精密度试验

将同一瓶CSFV疫苗分成6份进行RNA提取，并以此作模板进行试验。X轴为CT值，Y轴选用Rn，进行CSFV实时荧光定量PCR方法精密性验证。

1.2.3 准确度试验

设计一组样品，这一组样品中含有猪瘟病毒的样品和不含有猪瘟病毒的样品都需包括，并送到具备猪瘟病毒实时荧光RTPCR检测能力的实验室进行对比检测。

1.2.4 特异性试验

以选中的反应体系、条件为参考，扩增制备于1.2.1中的PPV、PRV、PCV2的DNA和O-FMDV、PRRSV、CSFV的RNA，并设置阴性对照和阳性对照。

2 结果

2.1 精密度试验

精密度检测结果（见图1）：6次检测CT值分别为23.2、23.4、23.3、23.7、23.6、22.9，变异系数为1.10%。

图1

2.2 准确度试验

对设计的一组样品进行对比检测，检测结果一致，因此该方法检测CSFV具有良好的准确度。

2.3 特异性试验

借助本文所制定的方法扩增含的CSFV的疫苗，会有阳性扩增信号出现，而PPV、PRV、PCV2、O-FMDV、PRRSV的核酸模板并未有阳性扩增出现（见图2），说明本方法具有良好的特异性。

图2

3 讨论

对于中国养猪业而言，CSFV所造成的危害十分严重。当前，我国拥有众多猪瘟疫苗生产企业，但是所生产的疫苗质量之间差异十分明显，时常出现失败的免疫，再加上CSFV临床表现十分复杂，缺乏典型性病例，仅靠临床症状几乎无法确诊。快速、特异、敏感的分子生物学诊断方法的研发有利于CSFV的快速检测[2]、CSFV病原阳性猪的淘汰及净化猪群猪瘟。

该方法采用提取样品中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，可检测多种样品阳性猪瘟病毒，而特异性扩增并未在其它不含CSFV的样品中出现，准确度和精密度试验结果也成立，这表明了该方法具有较为良好的特异性、精密度和准确度。

综上所述，本文所提出的CSFV实时荧光定量PCR检测方法具备快速、特异、准确等特点，故而在CSFV快速检测中十分适用。