赛鸽源鸡杆菌复合群-3的分离鉴定与药敏试验

王洪彬，朱利霞，高桂生，史秋梅

(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛066600)

鸡杆菌属细菌是革兰氏阴性杆菌，由输卵管鸡杆菌、鸭源鸡杆菌、海藻糖发酵鸡杆菌、虎皮鹦鹉鸡杆菌及3 个复合群组成[1-3]。鸡杆菌病是近几年来国内新发现的一种细菌性传染病，其病原菌鸡杆菌是一种条件性致病菌，具有广泛的感染谱，其中鸡是最常见的感染宿主，不同品种、日龄鸡均可感染发病，主要引起心包炎、败血症、肝炎、呼吸道疾病等[4]。近年来，由该菌属细菌引起的细菌性疾病呈逐年增加趋势[5-7]，给养殖业造成了一定的经济损失。本研究从送至河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室的病死赛鸽心脏、脾脏、肺脏、肝脏等组织样品中分离得到病原菌，对其进行动物致病性试验及药敏试验，为赛鸽养殖中由鸡杆菌复合群-3 引起的细菌性疾病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料样品及实验动物 2018 年8 月份，辽宁省某赛鸽场养殖人员将病死赛鸽送到河北科技师范学院-河北省重点实验室，发病赛鸽主要临床表现为怠倦不飞、厌食消瘦等。10 只健康种鸽购自秦皇岛某养殖场。

1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)和胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)购自北京奥博星生物技术有限责任公司；细菌基因组提取试剂盒、DL2000 plus DNA Marker、dNTP、EXTaqDNA 聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司；血平板购自郑州安图生物工程有限公司；Gel extraction kit(100)购自Omega公司；常规药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；pMD18-T 载体、DH5α 大肠杆菌感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；自动生化鉴定系统ID32E 鉴定试纸条购自法国梅里埃公司。

1.3 病原菌的分离纯化 无菌采集病死赛鸽心脏、脾脏、肺脏、肝脏等组织样品，用无菌接种环接种于TSA 平板上，于37 ℃培养24 h；挑取优势菌株的单菌落于血平板划线纯培养，并经革兰氏染色，镜检观察。

1.4 病原菌的生化鉴定 利用ID32E 生化鉴定试纸条进行细菌生化鉴定，由ATB 全自动微生物鉴定系统判定结果。

1.5 分离菌株的16S rDNA 鉴定及系统发育树的建立 利用细菌基因组提取试剂盒提取分离菌株基因组DNA；利用16S rDNA 通用引物对分离菌株进行PCR 扩增[8]；回收阳性产物并克隆于pMD18-T 载体，转化至DH5α 大肠杆菌感受态细胞；利用蓝白斑筛选出白色菌落，并经PCR 检测阳性的菌液由北京生工生物工程技术服务有限公司测序。

将测序所得的序列与GenBank 数据库中相关病原16S rDNA 基因序列比对并构建系统发育树，分析其同源性。

1.6 动物回归试验及药敏试验 将病原菌单菌落接种于TSB 中，于37 ℃培养24 h，并计数；以无菌PBS 稀释至终浓度为1.0×109cfu/mL，随机选取5 只健康种鸽作为实验组，种鸽通过气管注射[1]上述菌悬液0.2 mL/只；剩余5 只种鸽作为对照组，注射无菌生理盐水0.2 mL/只。对照组和实验组隔离饲喂，观察种鸽的临床表现。对病死种鸽及时剖检，观察病理变化，分离鉴定病原菌。

按照美国临床实验室标准委员会(CLSI)推荐的抗菌药物敏感性试验执行标准，采用K-B 纸片扩散法对分离菌进行药敏试验。

2 结果与讨论

2.1 分离菌株的形态特征 对病死赛鸽心脏、脾脏、肺脏、肝脏等组织样品进行细菌分离，结果从心脏、脾脏、肺脏、肝脏等组织样品中均分离纯化得到1 株形态特征一致的优势菌株；在TSA 平板上长出乳白色、边缘整齐、凸起、不透明菌落；在血平板长出光滑、圆形、凸起、不溶血菌落；革兰氏染色结果显示，分离菌株为革兰阴性短杆菌，菌体两端钝圆，多呈单个或成对排列，命名为HLD-1。查阅文献，分离菌株HLD-1 的形态特征与鸡杆菌复合群-3 的形态特征一致。

2.2 分离菌株的生化鉴定 对分离菌株HLD-1 进行生化鉴定。结果显示，分离菌株HLD-1 具有脂酶、L-天冬氨酸芳胺酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳酸苷酶、鸟氨酸脱羧酶活性，无精氨酸双水解酶、β-葡萄糖苷酶、赖氨酸脱羧酶、α-葡萄糖苷酶、尿素酶活性；吲哚反应和酚红反应均为阳性；不能发酵α-麦芽糖；丙二酸盐反应和肌醇反应为阴性。与《伯杰氏细菌鉴定手册》 比对显示，分离菌株HLD-1 生化特性与鸡杆菌复合群-3的生化特性相符。

2.3 分离菌株的16S rDNA 鉴定 以分离菌株HLD-1 的基因组DNA 为模板，进行16S rDNA PCR扩增。结果显示，扩增片段约为1 500 bp，与预期大小相符(图1)；测序结果与鸡杆菌复合群-3 基因序列一致，表明分离菌为鸡杆菌复合群-3。

将测序得到的16S rDNA 基因序列经Blast 比对分析，结果显示分离菌株HLD-1 的16S rDNA 基因序列与GenBank 中鸡杆菌复合群-3 相应序列同源性为99.7 %。对分离菌株HLD-1 构建系统发育树结果显示，分离菌株HLD-1 与输卵管炎鸡杆菌(Gallibac-terium salpingitidis)、海藻糖发酵鸡杆菌(Gallibacterium trehalosifermentans)、虎皮鹦鹉鸡杆菌(Gallibacterium melopsittaci)、鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)位于不同的进化分支中，而与鸡杆菌复合群-3(Gallibacterium genomosp.3)聚为一支(图2)，进一步证实了分离菌株HLD-1 为鸡杆菌复合群-3，且该菌株与欧洲株(EU339201.1)的亲缘关系最近，这与董文龙等[1]报道一致。

图1 分离菌株HLD-1 的16S rDNA 基因的PCR 扩增Fig.1 Amplification for 16S rDNA gene of HLD-1 isolate by PCR

图2 分离菌株与相关菌株的系统发育树Fig.2 Phylogenetic analysis of the 16S rDNA gene of HLD-1 isolate and related strains

2.4 动物回归试验 将分离菌株采用气管注射的方法对种鸽进行致病性试验。结果显示，种鸽在接种24 h 后，陆续发病，主要表现为精神萎靡、羽毛凌乱、食欲下降等；接种3 d 后陆续死亡，剖检死亡种鸽可见气管内含有大量黏液且有出血现象，肺脏出血，肝脏肿大，个别种鸽肠道有少量出血点，与送检死亡赛鸽病变一致。无菌采集死亡种鸽心脏、脾脏、肺脏、肝脏等组织样品，进行细菌分离鉴定。结果显示，分离菌与接种的菌株菌落形态特征、生化鉴定特征、16S rDNA 基因序列一致。对照组种鸽活动无任何异常。表明，此次分离到的鸡杆菌复合群-3 对种鸽具有一定的致病性。

鸡杆菌复合群-3 最早发现于欧洲国家；在国内，杨晓林等报道从四川某种鸽场的种鸽肺脏、肝脏、输卵管等样品组织中分离到该菌，病鸽主要临床症状为呼吸困难、气管出血、肺出血、输卵管炎等[9]；董文龙等报道从吉林省某信鸽繁育场病死信鸽气管中分离到鸡杆菌复合群-3，且证实了该菌具有较强的致病性[1]，因此在兽医临床上不可忽视其对畜牧业的潜在威胁。

2.5 药敏试验结果 本试验选用临床常用12 种抗菌药物对分离菌株HLD-1 进行药敏试验。结果显示，分离菌株HLD-1 对β-内酰胺类氨苄西林、头孢曲松敏感；对其它抗生素不敏感(表1)。本实验中，发病赛鸽经头孢曲松治疗，其感染症状改善，很快痊愈，证实此次引起赛鸽发病死亡的病原菌是所分离的菌株，因此在辽宁地区的生产实践中，建议赛鸽在发生鸡杆菌复合群-3 感染时，优先使用头孢曲松、氨苄西林治疗。总之，在赛鸽养殖过程中一旦感染细菌性疾病，需结合动物机体实际情况，根据药敏试验结果合理用药。

表1 分离菌株药敏试验结果Table 1 Antimicrobial susceptibility testing of HLD-1 isolate