一株鸡大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及治疗试验

路建彪，王俊丽，吴伟胜，司振书，李玉保

(聊城大学农学院，山东聊城252059)

禽大肠杆菌病是由某些致病性或条件致病性大肠杆菌引起，是危害养禽业最为严重的细菌性疾病之一，在疾病预防和治疗过程中最易产生耐药性，导致抗生素用量增加和禽类产品药物残留等一系列问题。该病一年四季均可发生，但以冬春季节和气温多变时期多发，给养禽业带来严重的经济损失。禽大肠杆菌病在临床上主要通过抗生素防治，但由于抗生素的盲目添加或过量使用，导致大肠杆菌的耐药菌株不断增多、耐药谱不断扩大，进而导致治疗效果下降，养殖效益降低，同时对食品安全构成威胁[1]。目前，大肠杆菌病仍是危害畜禽养殖业的主要细菌性传染病之一。因此基于养殖效益、食品安全和公共卫生方面的考虑，寻找一种新的治疗大肠杆菌病疗效确实、无残留、符合国家减抗或无抗养殖发展方向的抗菌制剂乃当务之急[2]。

噬菌体作为细菌的天敌，可以裂解宿主菌，专一性强，高效，快速杀菌，不会感染畜禽机体，也不会产生耐药性[3]。噬菌体主要感染细菌，对动物机体和人体安全，不污染环境[4]。噬菌体作为抗生素的替代品，已经引起业内专家和相关企事业单位的广泛关注。本研究通过鸡大肠杆菌噬菌体的分离及其生物学特性的测定、大肠杆菌病的治疗试验，为大肠杆菌病的防治和无抗养殖开辟新思路、新方法，也是畜禽疾病防治研究的一个方向。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 15 份鸡新鲜粪便样品采集自聊城地区某大型肉鸡养殖场不同的鸡舍；实验用大肠杆菌E5 从上述病样样品中分离纯化并保存于本实验室；恩诺沙星溶液购自山东潍坊华英生物科技有限公司；硫酸庆大霉素购自河南正大动物药业有新公司。

1.2 大肠杆菌噬菌体的分离及纯化 参照文献[3]从采集的15 份鸡粪便样品中进行噬菌体分离及纯化。

1.3 噬菌体的生物学特性测定 将噬菌体裂解液10 倍倍比稀释，双层LB 培养基平板法培养噬菌体产生噬菌斑，选择噬菌斑数量在30～300 个的平板，计算噬菌体的效价，计算公式为效价(pfu/mL)=pfu×稀释倍数×10[3]。

取效价为2×1010pfu/mL 噬菌体裂解液0.5 mL分别放入温度为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃恒温水浴锅中，作用30 min 和60 min 时，检测噬菌体效价，平行检测3 次，取平均值。

取效价为2×1010pfu/mL 噬菌体裂解液0.1 mL与37 ℃预温的各pH(pH4～11)LB 液体培养基0.9 mL混合，37 ℃恒温水浴60 min，检测噬菌体效价，平行检测3 次，取平均值。

将MOI 分别为1 000、100、10、1、0.1 和0.01的噬菌体裂解液分别加入2.4×107cfu/mL 的大肠杆菌培养液中，37 ℃摇床中培养12 h，离心，0.22 μm滤膜过滤，并测定滤液中子代噬菌体的效价。各个比例重复做3 次，取平均值，以最高效价的MOI 作为最佳MOI[3]。

以最佳MOI 向试管中加入噬菌体和大肠杆菌，混合均匀，37 ℃温浴15 min，离心，弃掉上清，用37 ℃的液体LB 培养基洗涤沉淀2 次，最后用37 ℃LB 液体培养基10 mL，重悬沉淀，迅速放入摇床中，37 ℃、150 r/min 培养。每隔10 min 测定噬菌体效价，平行检测3 次，取平均值。以时间、效价对数值分别为横、纵坐标绘制曲线，即得噬菌体一步生长曲线。

1.4 鸡大肠杆菌病的噬菌体治疗试验 将128 只健康的7 日龄817 肉鸡随机分为16 组，每组8 只，其中3 组为对照组，1 组为空白组，同时设恩诺沙星和硫酸庆大霉素治疗组。连续饲喂168 h。除对照组2、对照组3、空白组外，其余各组分别腹腔注射大肠杆菌感染实验鸡，菌悬液浓度为2.4×108cfu/mL(经细菌计数测定)，0.5 mL/只。按照最佳MOI，分别在注射大肠杆菌前6 h、3 h、0 注射后3 h、6 h，其中5 组口服噬菌体裂解液，5 组腹腔注射噬菌体裂解液，浓度为2.4×108pfu/mL，剂量为0.5 mL/只，对照组，0：对照1 为腹腔注射大肠杆菌、对照2 为腹腔注射噬菌体裂解液，对照3 为口服噬菌体裂解液。抗生素治疗组：0，口服10 %恩诺沙星注射液，0.1 mg/只；硫酸庆大霉素，1 万单位/只，连喂3 d，1 次/d。空白组鸡正常饲喂，不做任何处理。记录各组鸡只的状态(疾病计分标准：1= 精神不振、闭眼、缩头、采食下降等，2= 死亡，0= 正常)。致病指数=疾病计分/总分。

2 结果与讨论

2.1 大肠杆菌噬菌体分离纯化 从采集的鸡场粪便分离得到一株噬菌体，命名为Bp1805，经过纯化后得到的边缘整齐、大小统一的透明的噬菌斑。对Bp1805 测定效价结果为2.4×1010pfu/mL。

2.2 噬菌体生物学特性测定 最适温度测定结果显示，Bp1805 对温度有一定耐受性，在40 ℃～50 ℃范围内效价基本不变，较为稳定，50 ℃～80 ℃范围内，随着温度的增加其效价下降很快，80 ℃降为零(图1A)。表明，Bp1805 最适温度为50 ℃以下。

最适pH 值测定结果显示，Bp1805 对pH 的适应范围较广，在pH5～pH10 仍能保持较高活性，效价在108以上；pH 在5 以下或10 以上，Bp1805 的活性开始下降(图1B)。Bp1805 最适pH 为6～8，效价在1010以上。

最佳MOI 测定结果显示，当MOI 1 时，Bp1805侵染大肠杆菌并裂解出子代噬菌体效价最高，达到2.35×1010pfu/mL，其MOI 为1。一步生长曲线测定结果见图1C，Bp1805 的潜伏期为20 min，裂解期为50 min。之后，噬菌体效价稳定在1.48×1010pfu/mL左右。

图1 噬菌体Bp1805 生物学特性测定结果Fig.1 Biological characteristics of phage Bp1805

2.3 大肠杆菌病的噬菌体治疗效果 口服和腹腔注射Bp1805 治疗大肠杆菌感染试验，结果显示，该噬菌体对鸡大肠杆菌病具有一定的治疗作用，抗生素治疗组致病指数分别为56.3 %和62.5 %，治疗效果较差(表1)。表明，Bp1805 对致病性大肠杆菌有很好的治疗作用，腹腔注射噬菌体效果优于口服方式，在大肠杆菌感染前注射噬菌体起到很好的预防作用，感染后的6 h 内起到一定的治疗作用。抗生素组致病指数高于噬菌体，可能与试验致病性大肠杆菌携带的耐药性有关。Bp1805 治疗大肠杆菌的治疗效果明显优于抗生素组。空白组鸡的疾病计分和致病指数均为0。

噬菌体具有对细菌特异、高效、快速杀伤的特性，特定的噬菌体只感染裂解特定的目标菌株[2,5]。噬菌体杀伤细菌能力强，在细菌体内大量复制增殖，但对人和动物是安全的[4,6]。能否分离鉴定多种噬菌体组成复合噬菌体制剂来防治细菌性疾病，甚至是防治多种细菌的混合感染，在养殖业将有很大的应用前景。噬菌体治疗试验结果显示，大肠杆菌噬菌体治疗效果与给药方式、给药时间有关。尽管噬菌体治疗细菌感染效果明显，但仍需解决如何延长噬菌体的保存时间、保存活性、准确把握给药时间、给药途径、提高给药的效率及安全性、科学评价噬菌体的治疗效果等难题[7-8]。

表1 致病指数Table 1 Intravenous pathogenicity index