云杉属树种体胚发生研究进展

李青梅 高芳 韩姣 孙悦 赵吉胜 陈士刚

摘要：体胚发生具有遗传稳定、繁殖快、数量多结构完整等优点，为云杉属树种细胞分化和全能性表达提供较为理想的理论体系。体胚发生的影响因素主要有，外植体的部位及所处生理时期、基本培养基的种类、植物生长调节物质的种类与浓度、糖的种类与浓度、以及培养条件等，不同因素对体胚发生的影响也不尽相同。本文综述了云杉属树种体胚发生的研究进展。

关键词：云杉属;体胚发生;再生植株;胚性愈伤组织

云杉属树种具有适应性强、抗逆速生等优点，是园林绿化与用材的重要树种。云杉属树种传统的繁殖方法为种子繁殖和扦插繁殖，种子繁殖存在繁殖周期长，优良遗传基因退化以及遗传性状不稳定的现象，且云杉属树种生长缓慢，一般要4～5年才能獲得可移栽的苗木。而扦插繁殖存在繁殖系数与成活率低等问题。在云杉属树种的育种工作中，利用体胚发生技术与传统的繁殖技术相结合，能够较好的解决这些问题。

体细胞胚胎发生是指双倍体或单倍体的体细胞（非合子细胞）在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发育过程。具有遗传稳定、繁殖快、数量多、结构完整等优点，并且具有以低成本繁育出大量高品质苗木的潜能。体胚发生技术在云杉属树种应用较为广泛，该技术为云杉属树种的品种改良和规模化繁殖提供较为理想的技术平台，本文综述了云杉属树种体胚发生的现状、影响因素及当前存在的问题，以便为云杉属树种建立高效的体胚发生体系提供借鉴。

1 云杉属树种体胚发生的研究现状

云杉属树种全世界约40种，我国云杉属树种资源丰富，有16种9变种。1985年Hakman等首次报道了挪威云杉体胚发生并获得再生植株，使云杉属树种体胚发生体系有了质的飞跃。经过近30年的研究，白云杉、黑云杉、红云杉、欧洲云杉、库页云杉、西加云杉、恩氏云杉、塞尔维亚云杉等云杉属树种的体细胞胚胎发生技术已有报道。从20世纪80年代以来，国内相继对原产我国的云杉属树种的体细胞胚胎发生进行了研究，其中，青杄、白杄、红皮云杉、沙地云杉、丽江云杉的体细胞胚胎发生究已有报道;其中挪威云杉、白云杉、黑云杉体胚发生获得了较为深入的研究，并且已经大规模的应用于造林实践中，带来了巨大的生态和经济效益。目前，挪威云杉作为云杉属树种的模式植物已经开展了从细胞学水平到分子水平的全面探索，特别是全基因组测序图谱的完成，对于阐明云杉属树种体细胞胚胎发生及其调控机制将发挥巨大作用。

2 体细胞胚胎发生过程

植物体胚发生方式可分为两种，即直接体胚发生和间接体胚发生。直接体胚发生即从外植体上直接诱导出体细胞胚，间接体胚发生即需要经过胚性愈伤组织诱导阶段，就目前对国内外云杉属树种的研究，属于间接体胚发生，其发育阶段分别为：愈伤组织诱导;愈伤组织保持与增殖;体细胞胚的发育与成熟;体细胞胚的萌发与植株再生;再生植株的移栽。

3 云杉属体细胞胚胎发生过程影响因素

3.1 愈伤组织诱导过程中的影响因素

外植体对愈伤组织诱导的影响：根据细胞全能性理论，植物任何细胞、组织、器官在适宜条件下，都有发育出完整新个体的可能，对许多树种的研究表明，以未成熟胚为外植体较成熟胚具有更大的潜能。在云杉属树种中以未成熟合子胚成功实现体胚发生的居多。外植体的生理状态也是极为重要的，因为外植体会随着生长季节而逐渐丧失胚胎发生的能力，在培养过程中，应采集胚胎发生较强生理状态的外植体。同时外植体的基因型对云杉属树种体胚发生影响较大，不同无性系外植体的同一采集时期和同一无性系的不同采集时期均会对试验效果产生巨大的影响。

培养基对愈伤组织诱导的影响：基本培养基的成分和状态对体细胞胚胎发生至关重要。云杉属树种体胚发生培养基较多，包括mLV、1/2mLV、LM、MS、1/2MS、改良P6培养基等。培养基的选择影响体胚发生的培养效果，不适宜的培养基会导致诱导效果差甚至会导致试验的失败。在培养基中氮素的形态对体胚发生起着重要的作用，通常在含有较高浓度的NH4NO3的培养基对体胚发生不利，明显降低NH4+和NO3-的浓度有利于提高体胚发生率。在植物组织培养中，培养基中是钾离子对体胚发生是必须的，钾离子是维持阴阳离子平衡的主要离子。在低氮素条件下，不适当的钾离子浓度的影响特别明显。

植物生长调节物质对愈伤组织诱导的影响：研究表明，影响体细胞分化的因素很多，但其中最重要的是植物生长调节物质。生长素是研究体胚发生最多的植物生长调节物质，在不少植物中已经证明是胚胎发生所必需的。2，4-D和NAA是针叶树种体胚发生较常用的植物生长调节物质。细胞分裂素在云杉属树种中也起到很重要的作用，常用的细胞分裂素有KT、TDZ和6-BA。其中6-BA作为常见。生长素和细胞分裂素的种类与浓度对云杉属树种体胚发生具有重要的影响，二者的浓度过高或过低或比例不当聚会对试验效果产生重要的影响。因此在试验过程中，应该妥善处理植物生长调节物质的种类与浓度，以便达到更好的效果。

环境因子对愈伤组织诱导的影响：环境因子对体胚发生的影响也较大，环境因子、培养温度、培养容器和培养状态均会对体胚发生的效果产生重要的影响。国内外云杉属树种体胚发生过程中，一般采用暗培养的研究方法。云杉属树种的体胚发生可以采用液体或固体的培养方法，但以固体培养基居多。

3.2 愈伤组织增殖过程中的影响因素

云杉属树种胚性愈伤组织的保持与增殖一般在生长素与细胞分裂素的共同参与下进行，生长素以2，4-D和NAA最为常见，细胞分裂素是以6-BA最为常见。在此过程中，一般要降低植物生长调节物质的浓度，继代周期以2周左右为宜，既能保持胚性愈伤组织的胚性，又能获得较大的增殖量。

3.3 体胚发育与成熟过程中的影响因素

体胚发育与成熟阶段一般在提高了渗透压的培养环境下进行，在云杉属树种中选用PEG4000居多，脱落酸（ABA）是一种天然的植物生长调节剂，ABA对体胚发生，尤其是对体胚成熟特别重要。研究表明ABA能够抑制胚的过早萌发对云杉属树种体胚成熟具有重要的影响，国内外成功实现体胚发生的云杉属树种均在培养基中加入了ABA，ABA的主要作用是促进体胚成熟，减少畸形胚的产生，抑制体细胞胚的过早萌发，防止针叶树种的裂生多胚现象。在云杉的研究中发现ABA能够促进体细胞胚的脂类和蛋白体的积累，因而促进体胚的成熟。

3.4 体胚的萌发与植株再生过程中的影响因素

体胚萌发即成熟的体细胞胚在适宜条件下发育成新的植株，包括成熟体胚的生根以及胚轴和子叶的伸长。云杉属树种体胚萌发与植株再生过程一般以WPM和MS为基本培养基，在此过程中一般降低蔗糖的浓度，撤除植物生长调节物质，添加低浓度的活性炭以提高植株再生率。关于体胚的萌发状况，不同的植株之间存在很大的差异。因此，在体胚萌发过程中，选取发育优良的植株使很有必要的。

4 展望

体胚发生是一个复杂的过程，包括一系列的生理生化反应和复杂的器官发生反应，同时影响体细胞胚胎发生的因素很多，从而给体胚发生技术的研究带来了巨大的困难。在今后的研究中，需要在现有研究的基础上进一步深化研究，要利用现代分子生物学技术分离与胚性发育相关的基因，进一步揭示云杉属体细胞胚胎发生分子机理及其调控机制，建立更多高效稳定的体细胞胚胎发生和植株再生体系。这些研究将为云杉属树种种质资源的保护提供理论依据，为体细胞胚胎发生在林业生产中的实际应用作出贡献。

基金项目：吉林省公益性科研院所行业科研项目（GY-2018-06）。

作者简介：李青梅（1980-），女，副研究员。主要从事林木育种和生物技术研究工作。

通讯作者：陈士刚（1976-），男，研究员。主要从事林木育种和生物技术研究工作。