长链非编码RNA 在膝关节骨性关节炎患者和健康人PBMCs 中的差异表达及其发病机制研究

唐荐 魏小华

膝关节骨性关节炎为临床常见的骨性关节炎疾病， 主要患病人群为中老年人， 主要症状表现为活动限制、关节畸形以及疼痛等， 长时间卧床患者会出现肌肉萎缩［1，2］。lncRNA属于RNA 分子， 其长度＞200 bp， 但并未对蛋白质进行编码。目前临床研究证实lncRNA 可对基因转录调控蛋白质产生影响， 和膝关节骨性关节炎发病机制存在关系［3，4］。本次研究主要探讨lncRNA 在膝关节骨性关节炎患者和健康人PBMCs中的差异表达及其发病机制， 现将研究过程具体报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料

选取2016 年12 月～2018 年12 月本院收治的40 例膝关节骨性关节炎患者作为观察组, 其中男24 例,女16 例, 年龄36～52 岁, 平均年龄(42.2±3.5)岁。另选取同期40 例健康体检者作为对照组, 其中男26 例, 女14 例；年龄34～55 岁, 平均年龄(43.5±3.9)岁。两组研究对象的性别及年龄等一般资料比较差异均无统计学意义(P＞0.05), 具有可比性。

1. 2 方法

1. 2. 1 细胞采集

抽取膝关节骨性关节炎患者和健康人外周静脉血, 采血量为5 ml, 将其放置在乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中, 对其进行离心后将血浆放置在1.5 ml 离心管(EP 管), 在-80℃冰箱中冻存；血细胞层经过离心后对淋巴细胞分离液PBMCs 予以适应, 完成离心后采用磷酸盐缓冲溶液(PBS) 0.1 mol/L 对PBMCs 细胞进行洗涤, 在-80℃冰箱中冻存［5,6］。总RNA 提取：总RNA 提取方法为Trizol, 首先选择相关提取试剂, 即mir Vana RNA 对患者以及健康人PBMCs 内的总RNA 进行提取, 对其进行纯化后选择相关设备分析总RNA 的质量以及定量。

1. 2. 2 lncRNA 分析表达

依据反向转录脱氧核糖核酸(cDNA)反转录试剂盒说明书对患者以及健康人总RNA 实施合成, 从而形成cRNA。需要标记cRNA, 采用Agilent Human lncRNA Microarray 芯片对产物进行杂交, 而后采用相关数据分析, 观察组lncRNA 变化和对照组相比＞2 倍说明具有差异表达［7,8］。生物学途径对差异表达的mRNA 功能属性进行分析, 创建其网络表达。和疾病相关的lncRNA 均选自Cis-以及Trans-进行分析。

1. 2. 3 验证试验

对差异表达lncRNA 进行选取, 验证对象为差异倍数较大的lncRNA, 内参为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH), 对其实施PCR 反应。PCR 反应条件如下：预变性95℃, 变形95℃, 退火58℃, 延伸72℃, 然后对患者和健康人的基因表达变化倍数进行计算。

2 结果

2. 1 mRNA 和lncRNA 差异 表达

Agilent Human lncRNA Microarray 芯片对产物进行杂交后, 通过相关软件检测有效数据可知, 观察组患者和对照组PBMCs 中的差异表达为1615 条, mRNA 差异表达数量大致为840 条, 同时倍数在2 以上。1105 条lncRNA 表达上调, 510 条lncRNA 表达下调。

2. 2 Go 以 及Pathway 相 关 分 析

对差异表达进行GO 分析后可知, mRNA 差异表达功能包含转录调节、蛋白激酶以及金属离子等。Pathway 分析认为其功能和B 细胞受损以及TNF 信号存在关系。创建其网络表达后, 获取216 对lncRNA-mRNA。通过Cis-及Trans-分析后可能和疾病存在关系的lncRNA 包含NONHSAT027875、FR378506 和NONHSAT031501。

2. 3 PCR 验证

验证实验针对差异表达倍数较大的部分lncRNA 和与膝关节骨性关节炎发病有关的lncRNA进行验证, 结果显示, MONHSTAT120696、uc.80+和NONHSAT031501 在扩大样本中得到较好的验证, 与芯片杂交的结果相仿。经PCR 验证, 与疾病存在关系的lncRNA 包括MONHSTAT120696、uc.80+和NONHSAT031501。见表1。

表1 PCR 验证试验与芯片杂交实验倍数变化比较

3 讨论

膝关节骨性关节炎是因为膝关节软骨变性和骨质增生产生的慢性骨关节疾病， 在临床中又称为膝关节增生性关节炎、退行性关节炎。疾病产生原因为关节软骨出现磨损， 关节间隙逐渐变窄以及软骨下骨质硬化。本病主要在于预防， 并且需要适当进行体育锻炼， 以免关节出现超负荷使用， 对畸形或其他致病因素进行及时矫正。

目前， 临床对于转录因子、微小RNA(miRNA)和信号通路向软骨分化和软骨细胞外基质(ECM)中起到作用研究较多， 对于lncRNA 的作用逐渐予以重视。lncRNA 属于一种非编码RNA， 依据基因和临近蛋白位置可将其划分为5 类。lncRNA 未参与蛋白质合成， 但是能够对蛋白合成起到调控作用， 即调控转录、核内运动以及转录后加工影响。lncRNA效果具有多样性特征， 在基因表达中意义重大， 表达异常会引发相关疾病。大部分临床研究表明lncRNA 和心血管疾病以及神经系统疾病均存在关系。

本次研究分析膝关节骨性关节炎患者和健康人PBMCs中差异表达， 以探究膝关节骨性关节炎的发病机制， 进而为临床治疗提供可靠数据。在膝关节骨性关节炎发展进程中，lncRNA 表观遗传变化对于膝关节骨性关节炎发展具有重要意义， lncRNA 能够经过乙酰化修饰组织蛋白， 对基因转录活性起到调节作用。为此lncRNA 表观遗传能力可制作出相关治疗药物。伴随基因时代的到来， 基因芯片杂交技术以及相关检测均已完善， 可更加深入lncRNA 的临床研究。

综上所述， 膝关节骨性关节炎患者中lncRNA PBMCs 具有差异表达， 同时可对蛋白质表达进行调控， 致使PBMCs 出现紊乱。然而还需要继续深入探究膝关节骨性关节炎患者发病机制， 为早期诊断以及治疗提供依据。