外泌体在类风湿关节炎发病机制和治疗中的作用

黄碧青，李 菁

作者单位:100730 北京，中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院风湿免疫科，风湿免疫病学教育部重点实验室

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA) 是一种病因未明的慢性、系统性、炎症性疾病，主要累及滑膜关节，是最常见的炎症性关节炎，人群患病率约为0.5%～1%[1]。不仅遗传和环境因素，吸烟、感染、低收入和低学历等也是RA 的危险因素[1]。近年有研究发现外泌体参与了RA 的发病机制，在维持关节稳态中发挥重要作用；同时也为RA 的治疗提供了潜在的新治疗途径[2]。本文就外泌体在RA 发病机制和治疗中的研究进展进行综述。

1 外泌体的定义和功能

细胞外囊泡 (extracellular vesicles，EVs) 是由细胞分泌的具有磷脂双分子层结构、不能自我复制的囊泡，可以通过其携带的蛋白质、脂质、核酸等生物大分子，调节受体细胞的生物学特性，参与细胞的生理学和病理生理学过程[3]。外泌体是EVs一个重要的亚群，通常认为外泌体是由多泡体与细胞膜融合而释放到细胞外的、直径为40～100 nm的膜性囊泡状小体[3]。外泌体携带的特定物质与患者的疾病状态可能有关，因此外泌体有望作为疾病的诊断标志物。另外，由于外泌体是磷脂双分子层囊泡，内含物相对稳定，是一种良好的给药载体[3]。

2 外泌体的纯化和鉴定

外泌体存在于多种体液中，包括血浆、尿液、乳汁、脑脊液、关节滑膜液等，从这些样品中分离纯化外泌体，对后续外泌体的鉴定和功能的检测具有重要意义。目前外泌体的分离方法包括差异超速离心法、密度梯度离心法、沉淀法、超滤法、亲和层析法、微流控技术等，根据特异性和回收率可以分为四大类(表1)[4]。囊泡国际协会2018 指南提出，目前最常用的外泌体分离手段依然是差异超速离心法。外泌体的鉴定需要观察单个囊泡结构和检测直径，方法包括可视化电镜、原子力显微镜、超高分辨率显微镜、纳米颗粒跟踪分析技术、高分辨流式细胞仪等[4]。

表1 外泌体分离方法比较Table 1 Comparison of isolation methods of exosomes

3 外泌体在RA 发病机制中的作用

3.1 外泌体的数量对RA 的影响

滑膜组织中淋巴细胞增生和凋亡失衡与RA 的发病机制有关[5]。APO2 配体/肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体[APO2 ligand (APO2L) /tumor necrosis related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) ]是肿瘤坏死因子超家族中的一员，以非依赖Fas/FasL 的 方 式 诱 导 细 胞 凋 亡[6]。Martinez-Lorenzo等[7]发现RA 患者滑膜液中外泌体表面携带的FasL 和APO2L/TRAIL 数量跟创伤性关节炎患者相比没有明显差异，但外泌体数量显著减少，因此无法诱导足够的T 细胞凋亡，从而维持RA 的炎症状态。

3.2 与外泌体相关的miRNA 在RA 发病机制中的作用

microRNA (miRNA) 是一种含有22 个左右核苷酸的单链非编码RNA，可通过结合mRNA 3' 端非编码区抑制靶基因表达[8]。目前有文献报道miR-16、miR-124a、miR-132、miR-223、miR-346、miR-363、miR-498 等与RA 的发病机制有关[9]。近期有研究发现外泌体相关的miR-155[10-12]、miR-146[10，13]、miR-17[14]等在调节炎症过程中发挥重要作用，可能也参与RA 的发病机制(表2)。

表2 外泌体相关miRNA 在RA 发病机制中的作用Table 2 Role of exosome-related miRNA in the pathogenesis of RA

RA 患者在未发病前血清中抗瓜氨酸蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibodies，ACPA) 就已经存在了，这提示B 细胞可能是RA 发病的核心机制[15]。与健康人相比，ACPA＋的RA 患者外周血中IgD-CD27-的记忆B 细胞表达的miR-155 显著升高，miR-155 通过结合转录因子PU.1 促进B 细胞受体(B cell receptor，BCR) 交联促进抗体的产生[11]。滑膜组织中单核细胞或巨噬细胞的浸润也与RA 的发病机制有关，通过趋化因子招募血液中的单核细胞到滑膜组织是RA 疾病进展的重要过程[16]。miR-155 还可以通过促进单核细胞分泌趋化因子来招募T 细胞和单核细胞进入滑膜组织，并抑制滑膜组织单核细胞或巨噬细胞表达CCR2，使炎症细胞浸润关节滑膜组织，参与RA 的发病机制[12]。外周血单个核细胞来源的miR-155 的拷贝数与DAS28、关节肿胀数目、血沉相关，miR-155有望作为RA 活动性的标志物[12]。

RA 患者外周血和滑膜液中CD4＋T 细胞高表达miR-146，过表达的miR-146 通过结合Fas 相关因子1 基因抑制T 细胞凋亡参与RA 的发病机制，而且体外实验发现TNF-α 可以促进T 细胞表达miR-146，miR-146 有望作为抗TNF 治疗RA 的疗效监测指标[13]。

Treg 细胞数量减少和功能缺陷也与RA 发病有关[17]。RA 患者血浆来源的外泌体携带的miR-17可以通过结合TGFβRⅡ抑制Treg 细胞分化参与RA的发病机制[14]。

3.3 外泌体携带的蛋白质在RA 发病机制中的作用

外泌体可以携带多种蛋白质，目前有文献报道外泌体携带的蛋白质可以通过调节炎症参与RA 的发病机制[18-22](表3)。

表3 外泌体携带的蛋白质在RA 发病机制中的作用Table 3 Role of protein carried by exosomes in the pathogenesis of RA

蛋白瓜氨酸化可产生新的表位被免疫系统识别产生ACPA，参与RA 的发病过程[1]。RA 患者滑膜液中外泌体表面携带的纤连蛋白通过整合素与IgG 和瓜氨酸蛋白结合为复合物，这可能可以解释为何大于60%的RA 患者同时有类风湿因子和ACPA[18]。纤连蛋白可以在没有树突细胞的辅助下直接刺激T 细胞活化，而瓜氨酸蛋白与其抗体形成的免疫复合物可能加强T 细胞活化[18]，从而参与RA 的发病机制。

DNA 结合抑制因子1 (Inhibitor of DNA binding 1，Id1) 是螺旋-环-螺旋转录因子家族中的一员，是细胞自我更新的标志[23]。RA 患者滑膜液和滑膜成纤维细胞分泌的外泌体中含有大量的Id1，Id1可通过活化Jnk 信号通路促进血管生成[19]；还可促进成纤维细胞增生、抑制IL-6 和IL-8 的分泌参与RA 的发病机制[20]。

TNF-α 可以活化AKT 和NF-κB 信号通路，促进滑膜成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶1 破坏细胞外基质，并阻断活化诱导细胞死亡途径从而抑制T细胞凋亡[21]。Zhang 等[22]发现RA 患者滑膜成纤维细胞分泌的外泌体表面有膜结合性TNF-α，用可溶性TNFR1 结合外泌体表面TNF-α 时，可部分阻断这种效应，说明外泌体携带的其他成分可能也参与了RA 发病的这一过程。

4 外泌体在RA 中的应用前景

由于外泌体是双层脂质囊泡结构，内含物相对稳定[3]；并且不同生理和病理条件下、不同细胞分泌的外泌体，其携带的内容物不一样[3]。因此，外泌体携带的特定物质与患者的疾病状态可能有关，外泌体有望作为疾病的诊断标志物[3]。此外，目前已有利用不同来源的外泌体治疗RA 动物模型的文献报道[24-28](表4)。

表4 外泌体治疗RA 动物模型的可能机制Table 4 Possible mechanism of exosomes in the treatment of RA animal model

4.1 外泌体具有作为RA 标志物的潜在价值

Hotair 是一种2.2kb[29]的长链非编码RNA。Song 等[30]通过芯片技术发现RA 患者血清外泌体中的Hotair 与健康人和C-反应蛋白高的非RA 患者相比显著升高，而且与RA 活动程度相关，通过检测外泌体携带的Hotair 可反映RA 患者的疾病状态，因此Hotair 有望成为RA 病情活动的特异性标志物。

4.2 外泌体在CIA 动物模型中的应用

不同来源的外泌体具有不同的功能[3]。Cosenza 等[24]发现利用间充质干细胞分泌的外泌体治疗CIA 小鼠可以有效减轻关节炎症，MSCs 分泌的外泌体是通过减少CD4＋T 细胞、CD8＋T 细胞、CD4＋IL-10＋Treg1 细胞和浆母细胞数量，增加CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 细胞、CD19＋IL-10＋Breg-like 细胞数量发挥抗炎作用[24]；若反复冻融外泌体会导致外泌体聚集、膜破裂或数量减少，影响其抗炎效应[24]。

Kim 等分别用IL-10[26]、IL-4[25]、FasL[27]、吲哚胺2，3-双加氧酶1 (IDO1)[28]转染骨髓来源的树突状细胞 (bone marrow derived dendritic cell，BM-DC) 及其分泌的外泌体 (Exo/IL-10、Exo/IL-4、Exo/FasL、Exo/IDO1) 治疗CIA 小鼠。研究发现无论是关节局部注射还是全身给予Exo/IL-10治疗CIA 小鼠，关节炎症都可以缓解[26]。该机制可能是通过抑制T 细胞增生，减少滑膜组织表达Hsp70，Hsp70 可使体内耐受型T 细胞转化为自身反应型T 细胞，从而发挥抗RA 治疗作用[26]。IL-4转染的BM-DC 和Exo/IL-4 是通过依赖MHC-Ⅱ和FasL/Fas 机制调节体内抗原呈递细胞和T 细胞活性，从而在CIA 小鼠治疗中发挥作用[25]。另外，Exo/FasL 治疗CIA 小鼠也是通过依赖MHC-Ⅱ途径减少抗原特异性T 细胞数量发挥抗炎作用[27]。Exo/IDO1 是以依赖B7 共刺激分子的形式通过消耗色氨酸和或产生有毒代谢物抑制T 细胞，并促进Treg 细胞的分化发挥免疫抑制作用[28]。虽然利用IL-10、IL-4、FasL、IDO1 处理过的BM-DC 治疗RA 效果与Exo/IL-10、Exo/IL-4、Exo/FasL、Exo/IDO1 相似[25-28]，但直接注射BM-DC 治疗RA，BM-DC 在体内代谢过程中可能会发生表型改变。而外泌体由于不含细胞核、无法自我复制、具有高稳定性；脂溶性高，可以跨越生物屏障，不会引起免疫排斥，治疗RA 可能更安全，更有效[3]。

5 小结

由于RA 发病机制复杂，虽然目前有研究发现外泌体携带的miRNA、蛋白质参与了RA 的发病机制，并且利用外泌体治疗RA 在动物模型上取得了一定的进展，但是目前还缺乏高特异性、高回收率的外泌体分离方法，需要开发新的技术以提高外泌体的纯化率和回收率。所以将其应用于RA 患者身上，还需要进一步研究外泌体的各种成分在RA 发病机制中的作用，以及这些成分之间的相互作用对RA 的影响，再开展临床研究。