鹿茸多肽研究进展

张玲莺 李墨翰 李乳姝 郑艳 杨梅 武俊瑞 乌日娜 岳喜庆

摘 要：鹿茸多肽占鹿茸总湿质量的50%～60%，是鹿茸中最为重要的生理活性物质之一。本文结合前人研究成果，综述鹿茸多肽的化学成分、提取方法和分离纯化方法，着重介绍鹿茸多肽对免疫系统、神经系统、心血管系统、骨骼系统的作用及其抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤等生物活性，并对鹿茸多肽的发展趋势及研究前景进行展望。

关键词：鹿茸多肽;化学成分;提取方法;分离纯化方法;生理作用

Abstract： Velvet antler polypeptides account for 50% to 60% of the total wet mass of velvet antler and are one of the most important physiologically active substances in velvet antler. This article presents a systematic review of previous studies on the composition of velvet antler polypeptides and the methods used to extract and purify them， with focuses on their effects on the immune system， nervous system， cardiovascular system and skeletal system and theiranti-fatigue， antioxidant， anti-tumor and other biological activities. Moreover， future trends and research prospects are discussed as well.Keywords： velvet antler polypeptides; chemical composition; extraction methods; separation and purification methods; physiological effects

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190226-033

中图分类号：R282.74                                     文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2019）06-0064-06

引文格式：

张玲莺， 李墨翰， 李乳姝， 等. 鹿茸多肽研究进展[J]. 肉类研究， 2019， 33（6）： 64-69. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190226-033.

http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Lingying， LI Mohan， LI Rushu， et al. Progress in research on velvet antler polypeptides[J]. Meat Research， 2019， 33（6）： 64-69. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190226-033.    http：//www.rlyj.net.cn

鹿茸是脊椎動物门哺乳纲鹿科动物马鹿（Cervuselaphus linnaeus）或梅花鹿（Cervus nippon Temminck）的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，前者称马鹿茸（青毛茸），后者称花鹿茸（黄毛茸）[1]。鹿茸作为我国传统的名贵中药之一，最早记载于《神农本草经》，至今已有两千多年的使用历史。马鹿与梅花鹿作为我国鹿茸资源的主要来源品种，在我国的分布十分广泛。马鹿分为8 个亚种，分别为阿尔泰亚种、阿拉善亚种、东北亚种、甘肃亚种、四川亚种、塔里木亚种、天山亚种和西藏亚种[2]。梅花鹿分为6 个亚种，分别为东北亚种、华北亚种、华南亚种、山西亚种、四川亚种和台湾亚种。马鹿与梅花鹿东北亚种的道地产区主要为吉林省和黑龙江省，其饲养量约占全国的1/2。据统计，目前鹿茸全球生产量每年接近1 300 t[3]。作为一种特殊的软骨组织和可连续再生的哺乳动物器官，鹿茸中含有多种活性因子，化学成分较为复杂且含有多种有机和无机成分，主要为蛋白质、多肽、氨基酸、维生素、激素、胶质、脂类、黏多糖、碱基、核酸、芳香族化合物、酶类、多胺、微量元素及其他无机物等[4-5]。现代医学研究表明，鹿茸的化学成分较为复杂，具有广泛的生理作用，如对免疫系统、血液循环系统、骨代谢及糖代谢的调节作用[6-7]。鹿茸多肽作为鹿茸中的天然活性成分，占鹿茸总湿质量的50%～60%，是鹿茸中最为重要的生理活性物质之一[8]，因此对鹿茸多肽的研究具有重要意义。本文介绍了鹿茸多肽的化学成分、提取方法及分离纯化方法，并着重介绍了鹿茸多肽对免疫系统、神经系统、心血管系统、骨骼系统的作用及其抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤等生物活性，综述了目前鹿茸多肽的研究进展与发展前景，以期为我国鹿茸加工行业的发展提供参考。

1 鹿茸多肽的化学成分

鹿茸多肽的化学成分及构成较为复杂，其中氨基酸是鹿茸多肽的基本组成单位。研究表明，鹿茸多肽中已检测出7 种必需氨基酸、11 种非必需氨基酸[9-11]。不同品种、同一品种不同部位的鹿茸多肽中氨基酸含量与种类差异很大，必需氨基酸中亮氨酸和缬氨酸含量较高，非必需氨基酸中甘氨酸、谷氨酸和丙氨酸的含量较高[9，11]。

同时，鹿茸多肽的分子质量也因品种、部位、提取方式的不同而有所差异：王华等[12]采用硫酸胺分级沉淀、凝胶层析柱及高效液相色谱柱对鹿茸多肽进行提取纯化，得到的多肽分子质量小于800 Da;周秋丽等[13]采用电泳与质谱相结合的方法，从梅花鹿鹿茸中提取出分子质量约为1～3 kDa的多肽;王丰等[14]通过凝胶过滤、离子交换、高效液相色谱、电泳及质谱等一系列技术手段，从马鹿鹿茸中提取出分子质量为3 095.1 Da的多肽;翁梁等[15]采用柱色谱及反相高效液相色谱等方法从马鹿鹿茸中提取出一种由32 个氨基酸残基组成（32肽）的分子质量为3 216 Da的单体多肽化合物，但该多肽在梅花鹿鹿茸多肽组分中未被检出，说明其极可能是马鹿鹿茸中特有的活性物质;张郑瑶等[11]从梅花鹿鹿茸中分离出一种新多肽，并进一步通过激光解析电离飞行时间质谱法（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）分析得出该多肽的分子质量为3 263.4 Da，氨基酸序列为VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM，此梅花鹿鹿茸多肽与翁梁等[15]提取的马鹿鹿茸多肽在结构上较为相似，均由包含32 个氨基酸残基的直链多肽组成，但第5、8、11和30位氨基酸残基不同;严铭铭等[9]从梅花鹿鹿茸中分离提取出1 种分子质量为1 479.902 8 Da的单体多肽CNT14，并使用电喷雾串联质谱法测得其氨基酸序列为EPTVLDEVCLAHGP;霍玉书等[16]利用分子筛从冷冻鹿茸的缓冲液提取物中分离得到的蛋白质多肽类物质分子质量在10 kDa以上。

2 鹿茸多肽的提取工艺几种常用的鹿茸多肽提取方法及其优缺点如表1所示。

2.1 萃取法

有机溶剂在自然界中分布广泛，使用有机溶剂对鹿茸多肽进行萃取不仅造价低廉、安全无毒性，而且方便后续回收和处理。乙醇常被用作萃取剂来提取鹿茸中的蛋白质及多肽等有效成分，董万超等[23]采用乙醇萃取法对梅花鹿鹿茸多肽进行提取，成功分离出2 种不同组分;吴庆燕等[24]分别采用乙醇和丙酮提取鹿茸多肽，并对鹿茸多肽的活性进行检测;张展[17]采用乙醇萃取的方式提取鹿茸多肽，并证明分子质量0.5～0.6 kDa的寡肽促进人脂肪间充质干细胞增殖的效果最好。在我国绝大部分鹿产品加工厂内，萃取法是提取鹿茸中有效成分最为普遍的手段。但是在采用有机溶剂萃取鹿茸多肽时，会对鹿茸多肽的活性造成一定的破坏，并且提取过程要始终保持低温，增加了提取成本。

2.2 酶解法

酶解法提取鹿茸多肽不受温度条件的限制，在对酶种类、反应温度、反应时间、酶添加量及pH值等条件进行合理分析及实验，筛选出最佳组合后，能提取出活性更强、纯度更高、产量更多的鹿茸多肽，更有利于工业化生产。徐明等[18]将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶两两组合，筛选出的最佳提取组合为温度48 ℃、pH 7.2、底物质量浓度7.5 g/100 mL、酶浓度6 000 U/g、胰蛋白酶和复合蛋白酶比例1∶1、水解时间4 h，在此条件下水解度为32.5%，多肽得率为72.8%;王华等[12]考察酶用量、底物浓度和反应时间对酶解法提取鹿茸多肽的影响，确定最佳条件为酶与底物质量比1∶150、底物与溶剂质量比1∶13、水解时间60 min，最终测得蛋白含量为70.45%。由此可见，酶解法提取鹿茸多肽的提取率高于萃取法，但酶解法在提取前大多需要进行醇提，且需要调控的因素过多，最佳提取条件较难确定。

2.3 超声波法

超声波法提取鹿茸多肽采用超声波振动的方式，溶剂快速进入样品中，将鹿茸多肽尽可能完全地溶解于有机溶剂中。才凤等[25]采用超声波法提取鹿茸多肽，经正交试验得出最适条件为料液比1∶10、提取3 次、提取时间10 min;朱国丰[26]对提取时间、提取次数、浓度及pH值进行优化，筛选出的最佳条件为乙醇胺-盐酸提取液pH值为10.0、浓度4.0 mol/L、提取时间15 min、提取7 次，在此条件下鹿茸多肽的提取率为95.31 μg/g。超声波法提取鹿茸多肽耗时较短、成本低、适应性广、提取物产量高且提取的鹿茸多肽活性较强，因而成为目前许多鹿产品深加工企业提高产品质量的首选。

2.4 高压脉冲电场法

高压脉冲电场提取法将液态的鹿茸多肽溶液作为电解质，利用高压电场产生的高强度脉冲破坏细胞膜，改变其通透性，使细胞内容物流出，从而达到提取效

果[27]。趙景辉等[28]利用高压脉冲电场法提取鹿茸多肽，并经正交试验确定最佳组合为电场强度22 kV/cm、脉冲数8、料液比1∶12，最终鹿茸多肽的提取率为1.72%。高压脉冲电场法提取鹿茸多肽能将提取时间缩短至1 s内，最大程度减少多肽活性的降低，同时产量极高、操作便捷，未来有望成为鹿茸多肽提取的主流技术方法。

2.5 超微粉碎法

超微粉碎法指利用机器本身或流体动力将物料颗粒粉碎至微米甚至纳米级超细粉末的过程。李超华等[29]研究表明，超微粉碎法提取鹿茸多肽产量大、含量高、神经保护作用强，提取率高达14.892%。超微粉碎过程可在低温状态下进行，避免了局部过热的现象，并且粉碎速度较快，粒径分布均匀，能够最大限度地保留鹿茸多肽的生物活性，有利于提高提取率。

2.6 其他方法

提取鹿茸多肽的方法有很多，但每种方法各有利弊，表1列出了几种常用的鹿茸多肽提取方法及其优缺点。目前很多学者采用将表1中2 种或2 种以上方法结合的手段提高鹿茸多肽提取率，如酸醇-酶解结合法[18]、匀浆-超微粉碎结合法[20]、CO2超临界萃取法[21]等。但是由于鹿茸多肽极易受到温度、化学试剂等因素影响而变性失活，因此对鹿茸多肽提取工艺的优化仍有待研究。

3 鹿茸多肽的分离纯化

3.1 盐析法

鹿茸多肽在硫酸铵、硫酸镁、氯化钠等中性盐溶液中的溶解度随含盐量的增加而上升，而当含盐量上升到一定质量浓度时，鹿茸多肽溶解度却不断降低直至析出，这一过程称为盐析。刘唯佳[30]采用硫酸铵盐析分级沉淀与超滤杯结合的方法对鹿茸多肽进行分离纯化，提高了多肽提取率。盐析法操作简便，成本低廉，但在透析脱盐过程中蛋白质和多肽极易析出，使其变性失活。

3.2 超滤法

超滤法提取鹿茸多肽是在压力或离心力的作用下，使小分子多肽和水通过超滤膜，而大分子物质则被截留，从而达到分离纯化的目的。郝洁[31]用超滤技术提取鹿茸中的有效成分，分别用普通聚醚砜（polyethersulfone，PES）超滤膜和改性PES膜对胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）的提取进行对比实验，对鹿茸多肽的分子质量、pH值、压力和浓缩倍数等因素进行正交试验，最终得到超滤法提取的最佳组合为分子质量10 kDa、压力0.3 MPa、pH 12、浓缩倍数1.25 倍，此时膜回收蛋白率为69.20%。实际操作中，样品的密度、超滤膜的透过性、压力及流速等条件均会对结果产生影响，因此要根据提取多肽的分子质量选择适宜的超滤膜及超滤条件。

3.3 离子交换法

离子交换色谱主要分为阳离子交换柱和阴离子交换柱，主要根据蛋白质或多肽所带电荷的差异选择柱型，影响离子交换色谱分离效果的因素主要有pH值、离子强度、洗脱剂等。王本祥等[32]采用离子交换色谱法从马鹿鹿茸中提取出分子质量为3.2 kDa的多肽，并证明其具有促进骨和软骨细胞增殖的能力。离子交换色谱法能够分离出纯度较高的多肽，并进一步得到纯度更高的肽。同时，离子交换柱可以反复使用，节约成本。

3.4 电泳法

电泳法利用带电粒子在电场中移动速度不同而将鹿茸多肽分离出来。周秋丽等[13]对梅花鹿鹿茸多肽和马鹿鹿茸多肽分别采用电泳法和质谱法进行分离分析，并且对其化学组分及生物活性进行研究。结果表明，梅花鹿鹿茸多肽与马鹿鹿茸多肽的组成差异较为显著。电泳法设备简单、操作方便、分辨率较高，同时还可以准确、清晰地观察到鹿茸多肽分子质量的大小，进而能够更加直观地判断各种组分的含量。

4 鹿茸多肽的生理作用

4.1 对免疫系统的作用

免疫系统主要由免疫器官、免疫细胞及免疫活性物质构成，免疫系统分为固有免疫和适应免疫，其中适应免疫又分为体液免疫和细胞免疫。研究表明，鹿茸具有较强的免疫促进功能，从而增强机体的细胞免疫和体液免疫功能，而鹿茸多肽作为鹿茸的主要活性成分，经验证能够提高细胞免疫和体液免疫能力，具有明显的免疫促进功能[33-34]。从梅花鹿中提取分子质量为3.2 kDa的鹿茸多肽（nVAP32）用于小鼠免疫实验，结果表明，nVAP32能显著刺激脾细胞的增殖，增强淋巴细胞亚群的繁殖能力，同时nVAP32还显示出上调相关细胞因子表达的显著能力[35];进一步采用比色法评估脾细胞增殖和细胞杀伤活性表明，梅花鹿鹿茸重组多肽及其天然对应物均能明显刺激脾细胞增殖，提高脾细胞的增殖能力，而rVAP32也有望作为天然产物nVAP32的替代物研制新的生物制药产品[36]。也有研究指出，鹿茸多肽可以显著提高小鼠单核巨噬细胞的吞噬能力，加快小鼠T、B淋巴细胞的增殖，从而提高机体的免疫功能;同时，鹿茸多肽对多种急慢性炎症均具有明显的抑制作用，是鹿茸抗炎、镇痛的主要功能成分之一[37]。Kim等[38]采用鹿茸的水溶性提取液（含有蛋白质、多肽类物质）对胶原蛋白诱导的关节炎大鼠进行14 d的治疗，结果表明，鹿茸提取液能够抑制关节炎的恶化，减少骨吸收，这与Suh等[39]的研究结果相似，从而进一步证明了鹿茸多肽的免疫促进功能。另外，鹿茸多肽提取物还能够加快皮肤创伤的

愈合[33]。鹿茸多肽对于免疫系统的促进功能为鹿茸保健食品的研发提供了新的思路，未来也有望以鹿茸多肽为主要功能成分研发出增强免疫力、提高人体细胞防御力的功能性保健食品。

4.2 对神经系统的作用

神经系统是由神经元和神经胶质细胞构成的复杂机能系统，神经元是构成神经系统的基本机能单位。研究证实，鹿茸多肽可以加快胎鼠脑神经干细胞向神经元细胞分化的过程，同时提高分化细胞的数量，促进神经系统的再生作用，并且在一定使用剂量内呈现出剂量依赖性[40]。Wu Feifei等[41]指出，鹿茸多肽具有能明显改善东莨菪碱及亚硝酸钠诱导小鼠学习记忆障碍的能力。赵天一等[42]采用降支结扎法建立大鼠心肌缺血模型，实验显示，抑制神经细胞凋亡蛋白的表达在鹿茸多肽高、中、低剂量组中均增加，在模型组下降;促进神經细胞凋亡蛋白在2 组中的表达趋势则刚好相反，说明鹿茸多肽可以通过调节抑制神经细胞凋亡蛋白和促进神经细胞凋亡蛋白的比值来抑制神经细胞凋亡。也有研究证实，鹿茸多肽可以降低1-甲基-4-苯基-吡啶离子（1-methyl-4-phenyl pyridinium，MPP+）诱导的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞损伤，起到一定程度的神经元保护作用[43]。Zhang Lihong等[44]进一步发现，鹿茸多肽能够在体外诱导神经干细胞向神经元的分化，分化细胞与神经元极为相似，并且检测出一些特殊生长因子，如胶质细胞源性神经营养因子、神经生长因子等，而分化的神经元细胞可以表征为特殊的神经分子。鹿茸对神经系统及记忆力的增强作用使得日后相关产品的开发成为可能，但对相关通路的机理还有待进一步研究。同时，因鹿茸多肽对于神经系统在一定使用剂量内呈现出剂量依赖性，其使用安全性及毒副作用还有待进一步评估。

4.3 对心血管系统的作用

早在古代，鹿茸就已被用于心律失常、心衰等心血管系统疾病的治疗。心血管系统是一个封闭的管道系统，主要由心脏和血管组成，有关鹿茸多肽对心血管系统作用的研究也多集中在心脏细胞与血管细胞。Xiao Xiang等[45]采用液相色谱-质谱联用技术，对缺血缺氧条件下心脏微血管内皮细胞的增殖、凋亡情况及线粒体膜电位检测后发现，鹿茸多肽能够明显减少凋亡细胞的数量，增强心脏微血管内皮细胞的活力和增殖能力，并通过调节对应信号通路改善缺血缺氧诱导的心脏微血管内皮细胞损伤。Zhao Lihong等[46]用鹿茸多肽对横向主动脉缩窄术诱导的心脏纤维化大鼠灌胃后得出，鹿茸多肽能够破坏转化生长因子β1与其受体的结合，阻断血管紧张素的下游信号传导，从而达到对心脏的抗纤维化作用。Zhu Wenhe等[47]对过氧化氢诱导损伤的静脉内皮细胞的线粒体膜电位、细胞内活性氧水平及细胞凋亡相关蛋白进行检测后发现，鹿茸多肽能够显著增强其细胞生存能力，降低细胞凋亡率，并调节过氧化氢造成的下游信号传导凋亡的相关表达。目前市场上已经出现以鹿茸为原料的心脑血管保健食品及药品，但由于鹿茸多肽对心血管系统的作用机制并不完全明确，且对于以鹿茸多肽作为主要功能成分的靶向研究较为缺乏，因此高纯度鹿茸多肽的保健功能食品或药品仍有待开发。

4.4 对骨骼的作用

鹿茸多肽对骨质疏松具有一定的治疗作用，且疗效稳定，安全性高。目前对鹿茸多肽抗骨质疏松的研究较多：梅花鹿鹿茸多肽具有促进维A酸诱导骨质疏松大鼠成骨细胞增殖的作用，使骨吸收小于骨形成，起到抗骨质疏松的效果，且当多肽质量浓度为20 mg/kg时，软骨细胞和成骨细胞的增殖情况最好，骨折的愈合率最高[48];鹿茸多肽还能加快骨折大鼠骨痂的形成，促进骨痂内骨胶原和钙盐的积累，改善骨折部位的生物力学性能，从而缩短骨折愈合时间，促进骨折愈合[49];Li Na等[50]基于高分离度快速液相色谱-四极杆飞行时间质谱（rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry，RRLC-Q-TOF/MS）