表没食子儿茶素没食子酸酯在干细胞增殖及成骨分化作用中的研究现状

梅宏翔 张懿丹 张城浩 刘恩言 陈昊 赵志河 廖文

1.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医学院 成都 610041；

2.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院正畸科 成都 610041

牙周炎是常见的口腔疾病之一，能够破坏牙齿支持组织（包括牙槽骨和牙周膜），最终导致牙齿脱落[1]。随着干细胞成骨分化研究的深入，干细胞（尤其是骨髓间充质干细胞）疗法和基于此的骨组织工程成为牙周炎骨质流失治疗的新兴研究方向[2-3]。

循证医学证据显示，茶饮用量作为一个独立因素，与股骨、腰椎等处的骨密度呈正相关[4]。此外，绿茶能够抑制牙周炎的发生、发展，改善其牙周袋深度以及附着丧失[5]。这提示茶叶中的某些有效成分可能在牙周炎相关骨质流失的预防与治疗中发挥着重要作用。作为在茶叶中含量最多的儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）在成骨分化中的作用受到了药物研发者的广泛关注。

研究显示，EGCG在抑制牙周炎症[6]、延缓牙槽骨吸收[7]以及引导牙周组织再生[8]中发挥了重要作用。EGCG可以直接或者通过抗炎[9]、抗氧化[10]等途径作用于成骨分化通路，影响干细胞成骨分化，对骨重建有正向调节作用。这些研究为EGCG作为牙周炎相关骨质流失的辅助治疗药物提供了理论支撑，也为其对骨组织工程材料的改性奠定了基础。本文就EGCG在干细胞增殖及成骨分化中的作用进行综述，同时探讨该作用在组织工程材料改性中的应用。

1 EGCG简介

茶是世界上最受欢迎的饮品之一，茶多酚是茶叶中的主要成分，占茶叶干重的30%左右。超过80%的绿茶多酚是儿茶素（3,3,4,5,7-五羟基黄烷），即黄烷-3醇的衍生物。儿茶素主要由4种单体组成，分别是EGCG、表没食子儿茶素[(-)-epigallocatechin，EGC]、表儿茶素没食子酸酯[(-)-epicatechin gallate，ECG]、表儿茶素[(-)-epicatechin，EC]。其中，含量最多、药理作用最强的组分是EGCG[11]。EGCG含有8个羟基，是绿茶多酚中含羟基最多的化合物（图1）。

图 1 EGCG的结构Fig 1 The structure of EGCG

EGCG多羟基结构（尤其是B环上的邻二羟基和C环上的没食子酰基）赋予了其强大的自由基清除活性[12]。这也为EGCG的抗氧化[10]、抗肿瘤[13]以及促进牙周组织缺损修复[8]等药理作用奠定了基础。

2 EGCG对干细胞增殖的影响

研究者对于EGCG在干细胞增殖中的作用意见不一。多数研究[14-15]发现，浓度为2.5、5、10 μmol·L-1的EGCG均能够促进骨髓间充质干细胞的增殖，其中5 μmol·L-1的EGCG对增殖的促进作用最强。5、10、20 μmol·L-1的EGCG甚至能够阻断缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）对骨髓间充质干细胞活性的抑制作用[10]。即使对于脂肪干细胞，1.25和10 μmol·L-1的EGCG对其增殖活性的促进作用也较为显著[16]。但有研究[17]也提出，1 μmol·L-1的EGCG就能抑制小鼠间充质干细胞D1细胞系增殖。这种差异可能是实验使用的细胞来源和组成不同导致：前者使用从人骨髓组织中提取出的间充质干细胞；后者使用的细胞系则是由小鼠骨髓基质前体细胞克隆而来，虽具有多项分化潜能，但其主要成分仍为成骨细胞。

EGCG对细胞增殖的影响可能与多酚羟基结构有关。其独特的氧化还原微环境可以赋予其抗氧化或促氧化的双重能力[18]。研究[10,19-20]发现，10 μmol·L-1以下的EGCG可以增加细胞内的抗氧化酶，防止活性氧粒子（reactive oxygen species，ROS）介导的染色体损伤，抑制可能损害细胞功能的诱导性氧化应激；高浓度（＞50 μmol·L-1）的EGCG则会自动氧化，在培养基中产生过氧化氢，具有细胞毒性作用。因此，不同浓度的EGCG可能是通过调节ROS水平而影响细胞生长、增殖。

因此，适宜剂量（1～10 μmol·L-1）的EGCG能通过抗氧化途径促进干细胞生长、增殖，具有良好的生物安全性。这为牙槽骨吸和骨质疏松相关药物研发以及骨缺损重建提供了重要参考。

3 EGCG对干细胞成骨分化的影响

动物实验指出，EGCG能预防骨质疏松及促进骨重建[21]，并抑制牙周炎所导致的骨吸收[22]。这可能是EGCG通过抑制过度的氧化应激[23]以及炎症反应[22]而抑制破骨细胞形成，而对于EGCG是否能够直接刺激干细胞成骨分化尚未统一认识。

成骨细胞成熟包括3个主要的发育阶段：增殖、细胞外基质的沉积与矿化[24]。细胞外基质与细胞成骨相关基因的表达密切相关。研究发现，EGCG对于骨髓间充质干细胞成骨分化具有积极作用。Chen等[25]比较了茶叶中不同儿茶素对于D1细胞系成骨分化的影响，发现EGCG的促进作用最强。其他的研究[17,26]也证实，在EGCG的刺激下，干细胞的碱性磷酸酶（alkaline phospha tase，ALP）以及骨基质蛋白如Ⅰ型胶原、骨保护素、骨钙素等成骨分化标志性蛋白质出现了进行性上调。在转录水平也表现出相同的趋势。转录因子Runx2和osterix在骨标志性蛋白质形成早期起着至关重要的正向作用[27]，而晚期Runx2的过表达则会抑制成骨细胞成熟[28]。EGCG则能使Runx2早期上调而随后下调[29]，并促进osterix的表达[17]，有利于成骨分化以及骨结节的生成。

然而，EGCG对小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1成骨分化的影响引起了一些争议，Kamon等[30]认为EGCG以剂量依赖性的方式抑制MC3T3-E1细胞系成骨分化；而Sakai等[31]则发现EGCG增强了前列腺素-2α介导的骨保护素合成，从而促进成骨分化。但MC3T3-E1的多项分化潜能较弱，并不能藉此否定EGCG对干细胞成骨分化的正向作用。

4 EGCG促进干细胞成骨分化的机制

4.1 抗氧化应激途径

研究[32]表明，过量的氧化应激能够促进成骨细胞和骨细胞的凋亡，使骨形成速率减慢。已知ROS能够通过Wnt、Foxo、Hedgehog等信号通路抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化[33]。EGCG的多酚羟基结构赋予其强大的抗氧化功能，多酚羟基结构能够与过量的自由基如ROS结合，使其失去活性，从而终止自由基聚合反应[34]。因此，EGCG具有较强的抗氧化功能，能够阻断ROS的抑制作用，促进干细胞成骨分化。

4.2 抗炎途径

由于炎症能够促进骨质吸收和抑制新骨形成，牙周炎成为牙槽骨骨质流失的重要原因。EGCG的另一种作用就是抗炎，可能在抑制炎症性骨质流失中扮演着重要角色。有研究[9]证实，EGCG能抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠炎症性牙槽骨骨吸收。这可能与EGCG与层粘连蛋白受体（laminin receptor，LR）特异性结合而介导抗炎作用有关[35]。EGCG的处理能够通过LR依赖的途径下调Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）4的表达并且上调其负调控因子Tollip，来抑制TLR4/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/核因子（nuclear factor，NF）-κB信号通路的表达[36]。另一项研究[15]进一步证实，EGCG能够通过阻断NF-κB通路来抑制肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的生成，从而促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

4.3 经典的成骨分化通路

Wnt/β-连环蛋白（catenin）通路参与了骨量调节，能够控制全身所有骨骼的骨质发育以及防止成年后的骨质流失[37]。Wang等[38]发现，EGCG通过直接上调Wnt/β-连环蛋白通路元件的表达，促进骨髓间充质干细胞的成骨分化活性。

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）/Smad信号通路可能在EGCG的调节作用中也扮演着重要角色。Jin等[14]研究发现，单独使用EGCG对于骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用有限，仅能使BMP-2表达升高，并不能使其他成骨相关基因表达上升。Chen等[17]证实，EGCG能够促进核心结合因子α1（core-binding factor-α1，Cbfa1）的表达。而Cbfa1又能与细胞质BMP信号分子Smad结合，在诱导干细胞成骨分化中发挥关键作用[39]。这些研究说明EGCG促进成骨分化的能力可能与BMP/Smad相关通路存在潜在联系。

4.4 表观遗传途径

微小RNA（micro RNA，miRNA）在成骨分化以及骨折愈合中具有重要作用。研究[40]证实miRNA-210能够通过调节血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）参与缺氧调节的成骨分化。骨髓间充质干细胞经EGCG处理后，其mi-RNA210水平升高，从而促进成骨分化相关信号分子的表达。这可能依赖于miRNA-210对受体酪氨酸激酶配体-A3的3’非翻译区的靶向抑制作用[41]。

5 EGCG修饰的组织工程材料的应用

鉴于良好的生物安全性以及对成骨分化的促进作用，EGCG局部作用在骨折以及牙槽骨骨质流失的修复中可能有广阔的应用前景。因此，EGCG对骨组织工程材料的改性受到较高的关注。

目前，材料荷载被认为是药物局部低浓度持续释放的重要方式。有研究表明，EGCG/凝胶复合物能促进小鼠颅骨缺损修复。这可能与EGCG在体内缓慢释放并在凝胶崩解后继续附着于细胞表面有关，从而使EGCG能持续抑制炎症，促进小鼠间充质干细胞成骨分化[42]。

另一方面，EGCG与骨组织工程材料在诱导成骨方面存在着协同作用。Rodriguez等[43]将不同量的EGCG与α-磷酸三钙颗粒交联后填充于小鼠颅骨缺损中。结果显示，加载了0.1和0.2 mg EGCG的植入物能促进不规则骨小梁以及由成骨细胞构成的骨样群落的形成。这表明骨髓间充质干细胞成骨分化能力得到了进一步增强。

此外，Chu等[44-46]就EGCG对于胶原膜的修饰作用进行了系列研究，发现EGCG交联后不仅能够增强材料的促成骨能力，还能改善支架材料的物理性能、表面形态和机械性能，促进骨髓间充质干细胞增殖和黏附，降低炎性因子的释放。这表明EGCG可以作为引导性骨再生材料的常规交联剂，以发挥多重作用，促进骨缺损的修复。

这些研究都为EGCG应用于引导性骨再生提供了应用场景和理论依据。但是，由于高浓度的EGCG可以抑制细胞体外增殖及成骨分化[47]，并抑制小鼠体内的骨形成[43]，故不同临床应用方式下的最佳荷载浓度仍需要进一步的研究。

6 展望

EGCG作为茶叶的重要活性成分，已经受到了研究人员、医药厂商和公众的广泛关注。饮茶量与牙周炎症呈负相关的流行病学证据提示，EGCG在预防和治疗牙周炎症中具有巨大的潜力。然而，尽管许多实验都对于EGCG在抗牙周病原菌以及抗炎中的积极作用进行了肯定，但是其在牙槽骨再生的作用及其具体机制仍待进一步探索。

在基础研究方面，在考虑口腔应用环境复杂性的同时，还应进一步深入至干细胞成骨分化通路水平，逐步完善机制网络。同时，目前仍欠缺先进的成像技术对于动物实验提供系统性评价，以探究出最适浓度。而在未来的人体试验中，也应该注意浓度对于安全性和治疗效果的影响，并结合临床评价方法，以确定EGCG对骨质流失以及骨质缺损等的治疗效果。

就临床应用而言，EGCG的局部应用以及对于骨组织工程材料的改性可能对于局部骨质缺损有着更加重要的意义。一方面，材料能够局部缓释EGCG，以避免高浓度EGCG的毒性作用；另一方面，EGCG交联可以优化材料性能，并可能通过抗炎、抗氧化等多种途径协同促进成骨分化。在之后的临床实践中，应该根据不同的临床场景设计不同的研究方向，对于EGCG的应用量、交联方式、比例等进行探究，以满足各种临床需求。

鉴于EGCG良好的生物安全性和多重生理作用，其将为牙周炎相关骨质流失以及骨质缺损等疾病的治疗提供新思路和新途径。