胆囊结石伴胆囊炎患者胆汁中病原菌临床分布及耐药性分析

范陈良,李小四*，冯 燕，姚 娅，周 雪，宋国蓉，冯雪君，倪侃翔

0 引言

胆囊结石是临床上最常见的胆道疾病，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，其发病率越来越高，发病年龄已逐渐年轻化[1]。胆囊结石多伴发急性或慢性胆囊炎，诱发胆道系统感染，胆囊结石和胆道系统感染互为因果、相互作用。为探讨嘉兴地区胆囊结石伴胆囊炎患者胆汁中的病原学资料，本研究回顾性分析我院2017年1-12月确诊胆石症合并胆囊炎症患者胆汁中的病原菌分布和耐药性特征，旨在为肝胆外科围手术期或胆石症伴感染患者保守治疗提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 回顾2017年1-12月嘉兴市第二医院就诊患者中确诊胆囊结石伴胆囊炎并送检胆汁培养患者1 505例，其中男551例，女954例，平均年龄(56.3±7.4)岁，病例纳入标准：①经腹部超声检测和CT检查拟诊胆囊结石；②合并有胆囊炎症表现：突发性右上腹和(或)剑突下阵发性疼痛和(或)伴有恶心、呕吐等症状，发热、黄疸和(或)Murphy征阳性等。

1.1.2 菌株来源 回顾2017年1-12月以上临床资料所对应的胆汁培养阳性菌株，剔除同一患者同一部位重复分离菌株；质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923/ATCC29213、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853均购自卫生部临检中心。

1.1.3 仪器及试剂 BD-Phoenix全自动微生物鉴定系统及配套鉴定和药敏卡(BD公司)；VITEK-2 Compact型全自动微生物鉴定系统及配套鉴定卡和药敏卡(梅里埃公司)；药敏纸片全部来自英国Oxoid公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离与鉴定 分离纯化后的菌落，经全自动微生物鉴定系统鉴定细菌的具体种类。

1.2.2 药物敏感性试验 用BD-Phoenix型全自动微生物鉴定系统进行常规药物敏感性试验，并对操作做全程质量控制，质控菌株为ATCC29213、ATCC25922和ATCC27853；药敏结果判读参考美国临床和实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)抗菌药物敏感性试验执行标准M100-S26(CLSI M100-S26)[2]；真菌药物敏感性试验采取梅里埃真菌板条执行。

1.2.3 超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)检测 经全自动微生物鉴定系统初筛大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产ESBLs菌株，并按CLSI推荐的表型确证试验复核。

1.2.4 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌验证 经全自动微生物鉴定系统及药敏纸片扩散法初筛为耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌，并按照CLSI推荐的改良Hodge试验确认复核。

1.3 统计学分析 采用WHONET 5.5软件分析耐药率；采用SPSS 19.0软件统计分析耐药率差异，率的比较使用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病原菌临床分布 2017年1-12月共有526株胆汁培养阳性菌株，几乎全部来自肝胆外科病区(98.1%，516/526)，康复病区和ICU病区散在分布(1.9%，10/526)。

2.2 病原菌分布 共获得革兰阴性杆菌360株(68.4%)、革兰阳性菌147株(27.9%)、真菌19株(3.6%)；最常见的病原菌依次是大肠埃希菌(26.4%)、肺炎克雷伯菌(12.0%)、屎肠球菌(7.8%)、粪肠球菌(7.2%)和阴沟肠杆菌(6.3%)；革兰阴性杆菌中最常见的病原菌是大肠埃希菌(26.4%，139/526)、肺炎克雷伯菌(12.0%，63/526)和阴沟肠杆菌(6.3%，33/526)；革兰阳性菌中主要是屎肠球菌(7.8%，41/526)、粪肠球菌(7.2%，38/526)和链球菌属(19/526，3.6%)；真菌中最常见的是白假丝酵母菌(3.0%，16/526)。见表1。

2.3 主要革兰阴性菌对常见抗菌药物的耐药性

大肠埃希菌中，51.1%菌株产ESBLs，对β-内酰胺类抗菌药物耐药率高，但对亚胺培南、美罗培南、阿米卡星和替加环素的敏感性较好；肺炎克雷伯菌中，有30.0%菌株产ESBLs，对常见抗菌药物具有较好敏感性；耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌为3.0%，对第3代头孢菌素类药物(头孢噻肟、头孢他啶)耐药率较高。见表2。

表1 胆囊结石伴胆囊炎症患者胆汁中病原菌分布及构成比

注：*包括金黄色葡萄球菌、C2群沙门菌、宋内志贺菌、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、柯氏枸橼酸杆菌、黏质沙雷菌、摩根菌、恶臭假单胞菌、产酸克雷伯菌等

表2 主要革兰阴性菌对常见抗菌药物的不敏感率

注：—表示天然耐药；不敏感率包括中介率和耐药率

2.4 主要革兰阳性菌对常见抗菌药物的耐药性 屎肠球菌中未检出万古霉素耐药菌株，对万古霉素、利奈唑胺敏感性最高；耐万古霉素粪肠球菌检出率为2.6%，利奈唑胺和氨苄西林具有较高敏感性。见表3。

表3 主要革兰阳性菌对常见抗菌药物的不敏感率(%)

注：—表示未检测；不敏感率包括中介率和耐药率

3 讨论

胆道感染常是继发性感染，机体在生理条件下，胆道系统并没有微生物生长，只有胆道系统发生梗阻、狭窄、胆汁淤积等病理性改变时，胆汁无法排入肠腔，胆道压力上升，肠道内的菌群逆行进入胆道系统，继而引起胆道系统感染[3]。胆道感染也是临床上胆道手术常见的并发症之一，由于手术位置及部分生理的特殊性，胆汁培养极易产生多重耐药菌，胆道手术术后感染成为一个较为棘手的问题。因此，加强胆道感染病原学检查以及抗菌药物的敏感性试验，避免滥用抗菌药物；回顾性分析胆汁培养病原菌及耐药性的流行病学资料，对术后合理选择抗菌药物尤为重要[4]。

本研究结果显示，胆汁培养的病原菌主要以革兰阴性菌为主，其次是革兰阳性菌和念珠菌，这与李平等[3,5-6]的报道一致，但本研究中最常见的4种病原菌依然是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌和粪肠球菌，与以往文献报道略有差异，笔者认为这可能与手术部位、患者机体内肠道菌群差异以及本地区胆道系统感染特定流行病原谱有关，胆道手术患者术前粪便菌群分析和术后胆汁培养数据的对比研究目前正在进行中。

胆囊结石伴胆囊炎患者大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的ESBLs酶携带率均较高，总ESBLs携带率达到44.6%，高于王军等[5-6]的报道。ESBLs是一类由质粒编码介导的可以水解灭活青霉素类抗菌药物、头孢菌素(主要为第3代头孢菌素，如头孢他啶、头孢噻肟等)和单环β-内酰胺类抗菌药物(氨曲南等)的水解酶类统称，但对碳青霉烯类抗菌药物无水解能力。大陆地区主要以CTX-M型为主[7]，CTX-M型EBSLs对头孢噻肟的水解能力强于对头孢他啶，这与本研究大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对头孢噻肟的不敏感率高于头孢他啶相符，表明嘉兴地区胆道系统感染患者胆汁培养的病原菌携带的ESBLs酶，可能主要是CTX-M型，具体CTX-M亚型有待于进一步研究。结果显示，对于大肠埃希菌引起的胆道感染，碳青霉烯类抗菌药物(亚胺培南、美罗培南)、阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦是目前治疗胆道感染中大肠埃希菌的理想经验药物，头孢类抗菌药物并非最佳选择，且产ESBLs酶的大肠埃希菌对临床常用抗菌药物的不敏感性明显高于非产ESBLs酶的菌株，但对碳青霉烯类抗菌药物的不敏感性并无明显差异，这可能与本研究中碳青霉烯类抗菌药物在胆汁分离的大肠埃希菌中的耐药率极低有关；肺炎克雷伯菌对常见抗菌药物的敏感性均较好，左氧氟沙星、头孢他啶、环丙沙星、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、复方新诺明依旧是治疗的最佳选择，产ESBLs酶的肺炎克雷伯菌对临床常用抗菌药物的不敏感性明显高于非产ESBLs酶的菌株，美罗培南和复方新诺明在两者之间并没有明显差异。但产ESBLs酶的肺炎克雷伯菌对亚胺培南的不敏感性明显高于非产ESBLs酶的菌株，提示嘉兴地区胆汁感染的肺炎克雷伯菌，亚胺培南的耐药机制与ESBLs酶的类型间可能存在一定相关性，有待于进一步分子水平研究，临床分离的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的主要机制是产KPC-2酶合并细菌外膜蛋白异常[8]，碳青霉烯类抗菌药物是肠杆菌科细菌治疗的最后防线，面对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌或大肠埃希菌时，可选择的治疗药物并不多，如替加环素、多粘菌素、或者联合用药，但不良反应大，在治疗的过程中易发生对替加环素的继发性耐药[9]。结果表明，对于胆汁中分离的阴沟肠杆菌，阿米卡星、美罗培南、亚胺培南、环丙沙星、左氧氟沙星是理想的经验选择用药，阴沟肠杆菌的检出率与李平等[6]的报道基本一致，但与王军等[5]的报道存在一定差异，本研究中阴沟肠杆菌的检出率高于铜绿假单胞菌等非发酵菌，笔者认为这可能与嘉兴地区胆石症合并胆道感染患者肠腔菌群以及院感相关，有待进一步证实。

本研究结果显示，万古霉素、利奈唑胺、氨苄西林和环丙沙星是胆道系统感染粪肠球菌的最佳选择。值得注意的是，氨苄西林和环丙沙星在粪肠球菌中的敏感性明显高于屎肠球菌，氨苄西林和氟喹诺酮类药物(环丙沙星)已不再是胆汁中屎肠球菌感染的最佳选择。提示临床科室应该重视实验室菌株鉴定结果和药敏结果，合理选择抗菌药物。本文中嘉兴地区胆囊结石伴胆囊炎患者胆汁中屎肠球菌的检出率稍高于粪肠球菌，与绍兴、济南等[10-12]地区胆汁中肠球菌属的检出情况存在一定差异，笔者认为这可能与以下两方面因素有关：①不同地区、不同医院的临床与实验室中的院感情况差异；②本文中的肠球菌的菌株数量偏少。另外，屎肠球菌对氨苄西林的耐药率明显低于茅国峰等[10]的报道，笔者认为这可能与嘉兴地区胆汁中的屎肠球菌克隆型与其他地区存在一定差异有关[13]，实验室将展开肠球菌克隆分型及耐药性的相关研究；也可能与本文纳入的屎肠球菌数量偏少(41株)有一定关系。肠球菌中，仅1株粪肠球菌对万古霉素的敏感性下降(原始数据未给出)，与孙斌等[11]的报道基本一致，提示万古霉素对粪肠球菌和屎肠球菌依旧表现出强大的抗菌活性，但应警惕万古霉素耐药的肠球菌院内流行。预防万古霉素耐药的肠球菌暴发主要包括以下3个方面[14-16]：①抗菌药物的分级、合理使用，严格用药指针，正确解读微生物科的检测结果；②接触隔离，降低交叉感染，预防潜在暴发；③定期监测,包括日常监测和主动监测，尤其是ICU患者、移植患者、肾透析患者等高危易感人群的监测。研究显示，耐万古霉素肠球菌的耐药机制主要与药物结合的靶位改变有关，介导靶位改变的基因型分为VanA、VanB、VanC、VanD、VanE、VanG、VanL、VanM和VanN共9种，其中VanA、VanB、VanD、VanG、VanL、VanM和VanN为获得性耐药基因，VanC和VanE为先天性耐药基因[17]。

对胆道系统感染的治疗主要涉及3个方面：解除梗阻因素、通畅引流和抗菌药物合理使用。但是临床用药时机和获取准确的病原微生物的药敏报告之间存在一定的时间差，基于胆汁中病原菌的流行病学资料，经验性用药依旧重要，在经验性选择抗菌药物的同时，应该充分考虑以下几点：①药物在胆汁中的浓度；②药物的敏感性；③联合用药；④流行病学资料；⑤药物的代谢途径以及药物的次级代谢产物的抗菌活性。研究表明，哌拉西林/他唑巴坦在胆汁中的浓度可达到血药浓度的10倍以上[18]。本研究结果显示，哌拉西林/他唑巴坦也是感染性胆囊炎的理想经验用药。本院虽并未对胆汁中的厌氧菌做相关研究，但有报道显示，胆汁中的厌氧菌感染及其与需氧菌导致的混合感染占胆道感染总病例的50%～90%，尤其在急性化脓性重症胆管炎中最为常见[19-20]，甲硝唑是临床上较为经典的抗厌氧菌药物，目前对一般常见厌氧菌具有较高的敏感性，且在胆汁中具有较高的富集浓度和较长的有效药物作用时间[19]，在微生物报告没有出来之前，可以联合甲硝唑用于胆道系统感染的经验性用药选择，等待微生物科的准确报告后再做相应抗菌药物的变更。

综上所述，胆结石伴胆囊炎患者胆汁培养阳性率为34.9%；病原菌分布广泛，以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主，其次是屎肠球菌和粪肠球菌；而铜绿假单胞菌等肠道非发酵菌分离率较低；碳青霉烯类药物和万古霉素仍然具有较高的敏感性，肝胆外科围手术期，临床应根据术中胆汁培养的流行病原菌及药敏资料，合理使用抗菌药物。