杏鲍菇菌糠锰过氧化物酶提纯工艺研究

闫苗 罗青 赖春芬

摘要：锰过氧化物酶（MnP）是降解木质素等各种芳香类化合物的关键酶之一，具有很高的工业应用价值。优化了杏鲍菇菌糠锰过氧化物酶的提取条件，利用硫酸铵分级沉淀、双水相萃取、透析浓缩和冷冻干燥的方法获得一定纯度的成品酶。结果表明：粉碎时间30 s，摇床转速130 r/min，摇床时间1 h，提取温度30 ℃，水作为提取液并且料液比 1 g∶ 5 mL 的优化工艺下，经20%硫酸铵分级沉淀、双水相萃取、透析浓缩和冷冻干燥后获锰过氧化物酶3.075 U/g，回收率79.33%，说明杏鲍菇菌糠中锰过氧化物酶含量高，具有重要应用前景。

关键词：杏鲍菇;菌糠;锰过氧化物酶（MnP）;纯化

中图分类号： TS255.36  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）02-0297-05

目前，杏鲍菇已是市面上大量销售的食用菌之一，由此而来的菌糠处理问题也愈加严峻。现在，少数企业在工厂化生产杏鲍菇后将杏鲍菇菌糠就地燃烧，造成极大浪费的同时也污染了环境。尽管有学者对杏鲍菇菌糠进行了研究，如覆土栽培、制成饲料、双孢蘑菇栽培试验等处理，但杏鲍菇菌糠处理方式依然甚少，高效且生态的方式更少[1-5]。杏鲍菇能产生3种存在于白腐菌中的木质素酶，它们是漆酶、锰过氧化物酶（MnP）和木质素过氧化物酶[6-8]。杏鲍菇菌糠中残留了大量各种有利用价值的酶类[9-10]，MnP就是其中的一种。MnP能氧化一些很难被自然界氧化的木质素类化合物，在有机污染物的降解、纸浆漂白、染料脱色、褐煤的生物降解、处理农业废弃物、聚合链式反应催化方面有较好的应用前景[11-14]。目前，MnP工业化生产的方式有：通过改良产MnP菌株，筛选高产菌株，诱变选育来应用于大规模生产;利用克隆MnP基因、基因工程、细胞工程技术应用于实际生产[15-21]。现如今研究生产MnP的方式和方法还主要停留在实验室提取少量MnP作为研究材料，来研究MnP工厂化生产的适宜条件。因此需要高效便捷的提取方法以及工艺以满足工厂化大量生产MnP。基于此，本试验通过從杏鲍菇菌糠中提取分离MnP，优化浸提条件，通过硫酸铵分级沉淀、双水相萃取、透析浓缩冷冻干燥等进一步纯化MnP，这种方法不仅有效地利用了价格低廉的杏鲍菇菌糠，避免了杏鲍菇菌糠对环境的二次污染，而且高效地得到了工业利用价值极高的MnP，具有极高的工业化应用前景，开拓新的MnP发展市场。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验材料由福建农林大学生命科学学院特色食用菌品种创新与代谢工程团队于2015年10月下旬取自福建省正茸农业发展有限公司，选取颜色为灰黄色、硬度适中的杏鲍菇菌糠作为试验材料，并于福建农林大学生命科学学院105、107实验室进行后续试验。

1.2 主要仪器

试验所用主要仪器型号及生产厂家见表1。

1.3 方法

1.3.1 MnP粗酶液制备及蛋白质测定 粗酶液制备：取菌区中间部位并粉碎，取10 g，按照栽培料 ∶ 水=1 g ∶ 10 mL比例加入蒸馏水，130 r/min，25 ℃摇床培养1 h;8层纱布过滤混合液，10 000 r/min，25 ℃离心20 min，上清即MnP粗酶液，于4 ℃冰箱内保存备用。

利用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。

准确移取0.7 mL 4 mmol/L的愈创木酚、2 mL 100 mmol/L pH值为4.5的琥珀酸钠缓冲液、0.1 mL 2.5 mmol/L 的H2O2、0.2 mL 5 mmol/L的MnSO4 ，混合，摇匀，在40 ℃恒温水浴锅中水浴预热5 min。将上述混合试剂倒入容积为3 mL的比色皿中，465 nm处调零。加入0.2 mL粗酶液，立即记录吸光度，每隔30 s记录1次，共记录3 min。酶活单位定义为：每分钟吸光度变化0.01所需酶量为1个酶活力单位（U）。酶比活定义为：酶活力占总蛋白的量。

1.3.2 提取条件优化

1.3.2.1 粉碎时间及方式优化 手碎、粉碎机分别粉碎栽培料10、20、30、60、90 s，按照上述MnP粗酶液制备以及蛋白测定步骤测定，计算最优条件。

1.3.2.2 混合度优化 摇床中的转速分别为110、130、150 r/min，按照“1.3.1”节的MnP粗酶液制备以及蛋白测定步骤测定，获得最优条件。

1.3.2.3 混合时间优化 摇床中的混合时间分别为0.5、1、1.5、2 h，按照“1.3.1”节的MnP粗酶液制备以及蛋白测定步骤测定，计算最优条件。

1.3.2.4 提取温度优化 摇床中的提取温度分别为20、25、30、35 ℃，按照“1.3.1”节的MnP粗酶液制备以及蛋白测定步骤测定数据，计算最优条件。

1.3.2.5 提取液优化 提取液分别为纯净水、0.1 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液、0.1 mol/L的丙二酸-丙二酸钠缓冲液、0.1 mol/L的乳酸-乳酸钠缓冲液、0.1 mol/L的曲拉通 x-100 缓冲液、0.1 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，按照上述MnP粗酶液制备以及蛋白测定步骤测定各个提取液，计算最优条件。

1.3.2.6 料液比优化 按照栽培料 ∶ 水=1 g ∶ （4～15） mL比例加入蒸馏水40～150 mL，按照“1.3.1”节的MnP粗酶液制备以及蛋白测定步骤测定各个料液比下的数据，计算最优条件。

1.3.3 纯化条件优化

1.3.3.1 硫酸铵分级沉淀 根据以上各个条件的优化结果，最优条件下制备得到的粗酶液，依据25 ℃饱和硫酸铵浓度调节表，制成含20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%硫酸铵的粗酶液;25 ℃下摇床，130 r/min，7 h;25 ℃，10 000 r/min，10 min，离心3次。RO水溶解离心沉淀物质，吸取0.01 mL作为3 mL体系内的酶液。按照上述蛋白测定步骤测定各个离心管中上清液和沉淀数据，计算最佳硫酸铵分级沉淀数值。

1.3.3.2 双水相体系优化 参照双水相萃取方法，进行单因素试验。MnP粗酶1 g，10%的硫酸铵，设PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000浓度梯度均为10%、15%、20%、25%、30%、35%，加蒸馏水至总体系9 g，确定最佳聚乙二醇（PEG）种类以及浓度;再利用最佳的PEG种类以及浓度，硫酸铵浓度梯度设为5%、10%、15%、20%、25%，加蒸馏水至总体系9 g，确定最佳硫酸铵浓度;以最佳的硫酸铵浓度、PEG种类以及浓度，设NaCl浓度为0%、2%、4%、6%、8%，加蒸馏水至总体系9 g，确定最佳的NaCl浓度;最后结合对比数据，确定最佳的双水相体系。

1.3.3.3 透析除盐 取一定量的60%硫酸铵酶液沉淀溶解液按照透析方法除盐，每隔1 h换1次超纯水。12 h后透析结束。透析效果检查：用1% BaCl2检查（NH4）2SO4，如有白色沉淀，则继续透析，反之则可用1% AgNO3检查NaCl、KCl，直至透析液中无白色沉淀，然后将透析袋平整铺开在PEG 4000上，放置在4 ℃冰箱中进行反渗透检验。

1.3.3.4 冷冻干燥浓缩 将冷冻干燥后的固体加入5 mL超纯水溶解，取其中的1 mL液体稀释100倍，作为冷冻干燥后的酶液。选用最优双水相体系，冷冻干燥后的酶液1 g，加蒸馏水至总体系9 g，记录上下相的体积。按照上述MnP粗酶液蛋白测定步骤，采用3 mL反应体系（测定酶活力所用的反应体系为3 mL，即所加的酶液及试剂量总共3 mL）来测定冷冻干燥后的酶液、双水相最优体系上下相酶液以及浓缩液。

1.4 分析方法

试验数据采用SPSS软件LSD多重比较法进行单因素方差分析，用Excel软件进行绘图。

2 结果及分析

2.1 MnP粗酶液蛋白测定

由牛血清蛋白标准曲线获得线性方程为 y=0.005 71x+0.117 54（r2=0.999 41），由吸光度数值计算得到MnP粗酶液的蛋白质浓度为95.77 mg/mL，酶活为 9.577 U/mg。

2.2 提取条件优化结果及分析

2.2.1 粉碎方式及时间对MnP活性的影响 由图1可知，用手捏碎杏鲍菇废菌渣酶的回收活性最低，而用粉碎机粉碎 30 s 酶回收活性最高，為9.551 U/g，与其他处理方式及时间相比呈现显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）差异。随着粉碎时间的增加，酶回收率呈现出先上升后下降的趋势，说明粉碎机粉碎菌渣30 s时，菌渣的破坏程度最优，此时MnP溶出量最大，而时间再增加时，菌渣破坏程度更大，破坏了酶的活性，导致酶回收率降低。

2.2.2 摇床转速对MnP活性影响 图2显示了最佳混合度，当摇床转速为130 r/min时，酶回收活性最高，为 10.561 U/g，与110、150 r/min混合度相比，呈现出显著、极显著差异。随着摇床转速增加，整个酶活呈现出先增后减的趋势。在杏鲍菇菌糠中，存在大量有活性的菌丝体，转速产生的剪切力对菌体有破坏作用，从而抑制了MnP的合成和活性的表达。但转速过低，又会导致摇瓶内溶解氧含量相对不足，也会抑制MnP的合成及活性。

2.2.3 混合时间对MnP活性影响 混合时间影响MnP的回收。由图3可知，在混合时间条件优化中，随着时间增加，摇床混合时间1 h时酶回收活性最高，为12.321 U/g，与其他时间梯度相比有极显著的差异，之后随着时间增加，酶回收活性降低，这是由于混合时间太短，料液混合不充分，混合时间过长反而会使酶的活性降低。

2.2.4 温度对MnP活性影响 温度是影响酶活性的主要因素之一，在不同温度梯度下，将菌液培养1 h后，测定MnP的活力。由图4可知，30 ℃是酶的最佳回收温度，酶活力达 11.079 U/g，与20、35 ℃处理呈现极显著差异，但与25 ℃没有显著差异。一旦温度达到35 ℃时，酶的回收活性急剧下降，这是因为温度偏低或偏高均不利于酶的提取，温度偏低会使酶的活性达不到最优值，温度过高会使酶失活，活性降低。

2.2.5 不同提取液对MnP活性影响 图5显示了不同提取液对酶回收活性的影响，对比之下，在不同的提取液中，纯净水（RO）作为提取液时酶的回收活性最高，与其他各组的提取液相比有极显著差异，由此得出，水是最佳的提取液，其他提取液对酶的活性影响均比较大，均不适合作为酶的提取液。

2.2.6 料液比对MnP活性影响 由图6可知，采用 1 g ∶ （4～15） mL 的料液比提取MnP，随着料液比的增加，出现先增后减的变化趋势，当料液比为1 g ∶ 5 mL时，酶回收活性达到最大值，为11.562 U/g。在料液配比条件优化中，料液比为1 g ∶ 5 mL时，与其他试验组相比，呈现出显著性及极显著性差异，由此可知，水的配比越大，混合液在过滤时越容易流失MnP，不利于酶的提取。

2.3 纯化条件优化

2.3.1 硫酸铵分级沉淀结果及分析 上清液的酶活总量与沉淀的酶活总量之和是一个体系的酶活总量。从图7中的折线走势可以看出，随着上清液的酶活总量降低而沉淀的酶活总量升高。在硫酸铵浓度为20%时，酶活总量最高，为 11.87 U，此时上清液酶活总量几乎是整个酶体系的酶活总量，因此可以采用20%硫酸铵浓度进行上清液的除杂;而硫酸铵浓度为60%时，其酶活总量出现第二高，为 11.67 U，此时沉淀酶活总量几乎是整个酶体系的酶活总量，因此可以采用60%硫酸铵浓度进行沉淀的提纯。

2.3.2 双水相体系优化结果及分析 双水相萃取广泛应用于粗酶提取与回收，生产一些纯度较高的酶制剂，组成双水相系统的水溶性高分子聚合物大多数富含羟基，对酶有保护作用，酶在双水相系统中稳定好，酶的活性较高，萃取过程可以在室温下进行等诸多优点，在生物工程方面被广泛应用。图8-a为不同PEG种类上、下相数据变化情况，不同种类的PEG，分子量大小、聚合度不尽相同。在PEG种类确定中，PEG 4000的作用效果较好，酶的回收活性也最优，与PEG2000呈现极显著差异，与PEG 6000呈极显著差异，因此确定PEG为PEG 4000;图8-b为不同PEG 4000质量分数的提取效果：根据显著性差异分析，确定PEG 4000质量分数为20%;图8-c为在最佳PEG种类及浓度下检测不同硫酸铵质量分数的提取效果，根据差异性分析获得，硫酸铵质量分数为20%时，与其他质量分数的硫酸铵呈现显著或极显著差异;图8-d反映了在最佳PEG及硫酸铵质量百分数下，对比不同NaCl质量分数的提取效果，确定了NaCl的质量分数为4%。因此最终确定PEG 4000质量分数为20%，硫酸铵质量分数为20%，酶1 g，NaCl质量分数4%的双水相体系为最优双水相萃取体系。

2.3.3 透析浓缩、冷冻干燥结果及分析 表2显示了在不同纯化条件下酶参数的变化，在最优提取条件下得到的粗酶液酶活总量最高，且回收率为100%，但酶活力、总蛋白含量及酶比活均偏低。与粗酶液相比，经硫酸铵沉淀后，酶活力、总蛋白含量最高，呈现极显著差异。经PEG 4000萃取之后，酶比活最高，与粗酶液相比呈现极显著差异。透析浓缩、冷冻干燥后的酶比活是最优化提取条件下得到的粗酶液酶比活的2倍，经最佳硫酸铵分级沉淀，透析浓缩、冷冻干燥后可得到纯化1.43倍的MnP酶固体。

3 小结与讨论

MnP由真菌分泌，底物专一性比较弱，能有效分解芳香环类多聚体及一些难被生物降解的物质，因此具有极高的工业应用价值[11-14]。目前，从食用菌菌糠中提取MnP的工艺研究未见报道，从食用菌菌糠中提取MnP不仅扩大了获得MnP的来源，更是对价格低廉的菌糠的高价值利用[6-9]。本试验通过杏鲍菇菌糠MnP提取条件的优化，获得最佳的提取条件：粉碎机粉碎菌渣30 s时，菌渣的破环程度最优;混合时间为1 h时，混合最充分;料液比为1 g ∶ 5 mL最合适，水分过多，导致大量的酶在过滤时流失;提取温度为30 ℃时是酶的最佳提取温度，温度过高或过低都会降低酶的活性;摇床的最佳转速为130 r/min，转速过高会对酶造成损伤，过低料液混合不充分;RO水作为提取液提取MnP为最优;经硫酸铵分级沉淀即20%硫酸铵先沉淀，之后补足至60%硫酸铵，酶活有显著提高。最后经过透析浓缩、冷冻干燥后得到纯化1.43倍的MnP酶固体，之后固体溶解稀释，选用硫酸铵浓度20%，PEG 4000浓度20%，NaCl 4%，酶1 g，加蒸馏水至总体系 9 g，这时纯化倍数为1.93，酶比活最高，为3.336 U/mg。本研究透析浓缩、冷冻干燥后MnP酶活为3.075 U/g，每年产生的大量杏鲍菇菌糠可以用来提取MnP，而这些MnP用来降解农作物秸秆，必定可以产生可观的经济效益和生态效益。

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