HPLC法同时测定活血促愈胶囊中2种黄酮类和4种菲醌类成分的含量Δ

陈丹，李柯，卢茂芳，侯茜，李若存（1.湘潭医卫职业技术学院，湖南湘潭41110；.湖南省中医药研究院，长沙 41001；.湖南中医药大学药学院，长沙 41008）

活血促愈胶囊是由三七、积雪草、丹参、槐米等药材组成的中药6类新药，具有活血化瘀、消肿止痛的功效，临床用于急性软组织损伤及骨折[1-2]。其中，三七为方中君药，积雪草为臣药，丹参、槐米分别为佐药、使药。本课题组前期研究已建立了同时测定活血促愈胶囊中三七、积雪草中5种皂苷类成分含量的高效液相色谱法（HPLC）[3]。该方中丹参主要含有菲醌类成分（如丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ等），为活血化瘀的活性成分；槐米中的黄酮类成分（如芦丁、槲皮素、山柰酚-3-O-芸香糖苷等）具有良好的消肿止痛作用，均为该方的主要活性成分[4]。为了进一步提高质量控制水平，本试验建立了同时测定该方中芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA等6种成分的HPLC法，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT型HPLC仪（包括LC-20AT型二元泵、SPD-20A型紫外检测器、7725i-049型手动进样器）、LabSolutions 6.50 SP1系列工作站（日本Shimadzu公司）；XPE105型十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；HX-06型超声波清洗器（武汉恒信世纪科技有限公司）。

1.2 药品、药材与试剂

活血促愈胶囊（湖南省中医药研究院制剂室自制，批号：20161210、20170305、20170312、20170319，规格：0.56 g/粒，人参皂苷Rg1含量：≥4.0mg/粒，丹参酮ⅡA含量：≥0.4 mg/粒）；三七药材（批号：20160501、20160820、20161001、20161212）、积雪草药材（批号：20160612、20160911、20161105、20170110）、丹 参 药 材（ 批 号 ：20160515、20160725、20170118、20170126）、槐米药材（批号：20160501、20160911、20161212、20170104）均购自湖南上药九旺医药有限公司，经湖南省中医药研究院李若存研究员鉴定，三七为五加科植物三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]的干燥根和根茎、积雪草为伞形科植物积雪草[Centella asiatica（L.）Urb.]的干燥全草、丹参为唇形科植物丹参[Salvia miltiorrhiza Bge.]的干燥根和根茎、槐米为豆科植物槐[Sophora japonica L.]的干燥花蕾及花；芦丁对照品（批号：100080-200707，纯度：90.5%）购自中国食品药品检定研究院，山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品（批号：MUST-17040507，纯度：98.16%）、二氢丹参酮Ⅰ对照品（批号：MUST-17032705，纯度：98.40%）、隐丹参酮对照品（批号：MUST-17030403，纯度：99.34%）、丹参酮Ⅰ对照品（批号：MUST-17030210，纯度：99.09%）、丹参酮ⅡA对照品（批号：MUST-17101811，纯度：99.33%）均购自成都曼思特生物科技有限公司；聚酰胺（30～60目，柱层析用，国药集团化学试剂有限公司，批号：20160118）；乙腈为色谱纯，甲醇、乙醇均为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～10 min，15%A；10～30 min，15%A→21%A；30～60 min，21%A→75%A；60～75 min，75%A→15%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：20℃；检测波长：270 nm；进样量：10μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 取芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品适量，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA质量浓度分别为8 606.6、766.6、640.6、295.2、256.0、335.7 μg/mL的单一对照品贮备液。分别精密吸取上述各单一对照品贮备液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA质量浓度分别为 860.66、76.66、64.06、29.52、25.60、33.57 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取活血促愈胶囊内容物，研细（过三号筛），精密称取0.7 g，置于100 mL圆底烧瓶中，加甲醇50 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加适量水溶解，上样于已处理好的聚酰胺柱（3 g，30～60目，内径1.2 cm），水洗脱至无色后，加乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液30 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液 按样品的制备工艺和配方比例，分别制备缺丹参药材、缺槐米药材的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法分别制成缺丹参药材和缺槐米药材的阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，在该色谱条件下，各待测成分之间、待测成分与杂质峰之间得到分离，6种成分的分离度＞1.5，理论板数以芦丁计均大于5 000，详见图1。

2.4 线性关系考察

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于1 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得系列混合对照品溶液。精密量取上述混合对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，线性关系考察结果见表1。

表1 线性关系考察结果Tab 1 Results of linear range investigation

2.5 检测限与定量限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。当信噪比为3∶1时，得检测限；当信噪比为10∶1时，得定量限。结果，芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的检测限分别为0.08、0.01、0.01、0.01、0.01、0.01 μg/mL，定量限分别为 0.27、0.02、0.03、0.03、0.03、0.03 μg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA峰面积的RSD分别为0.78%、1.22%、1.67%、1.87%、1.92%、1.16%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20161210）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA峰面积的RSD分别为1.32%、1.25%、1.64%、1.98%、1.51%、1.49%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24h内基本稳定。

2.8 重复性试验

取样品（批号：20161210）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品含量。结果，芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的平均含量分别为37.82、1.93、1.03、1.18、0.50、1.07 mg/g，RSD 分别为 1.57%、1.92%、1.20%、1.41%、1.64%、1.09%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量样品（批号：20161210）适量，共6份，分别加入芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品溶液[此溶液的浓度是根据取样量中该成分的含量，按质量比1∶1配制]，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2Results of recovery tests（n＝6）

2.10 耐用性试验

2.10.1 色谱柱考察 取样品（批号：20161210）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件[色谱柱分别为Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm)、TECHI C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品含量，结果见表3。结果表明，当色谱柱发生一定程度波动时，本法能满足试验要求，提示其耐用性良好。

2.10.2 柱温考察 取样品（批号：20161210）适量，按

表3 耐用性试验结果Tab 3 Results of durability tests

“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件（柱温分别为18、20、22℃）进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品含量，结果见表3。结果表明，当柱温发生一定程度波动时，本法能满足试验要求，提示其耐用性良好。

2.11 样品含量测定

取4批样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并按外标法计算样品含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 4Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 讨论

以2015年版《中国药典》（一部）丹参、槐米含量测定项下方法[5]为基础，结合文献方法[6-12]同时测定了芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA等6种成分的含量。

3.1 测定成分的选择

本方中丹参为佐药、槐米为使药。研究表明，丹参所含的二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA均为菲醌类成分，均能明显提高骨折愈合区和成骨细胞数目，能阻止白细胞过度的游出和聚集，防止溶酶体酶、氧化代谢产物等过多的释放，减轻组织损伤，可控制炎症的发生；对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和β-内酰胺酶阳性的金黄色葡萄球菌有较强抑菌作用，其中隐丹参酮作用最强[13-15]。槐米所含的芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷均为黄酮类成分，其中芦丁能降低毛细血管的异常通透性、脆性，能维持血管抵抗力，可用于出血症的治疗和预防；山柰酚-3-O-芸香糖苷能抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，为活血化瘀的有效成分[16]。

本处方中4味药材所含主要活性成分是皂苷类、菲醌类及黄酮类。本课题组前期已对三七、积雪草中皂苷类成分的定量测定进行研究；二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA是丹参中的主要成分，2015年版《中国药典》（一部）丹参含量测定的指标就是丹参酮类[5]；芦丁是槐米的含量测定指标[5]，山柰酚-3-O-芸香糖苷为槐米中的另一主要黄酮类成分[17]。因此，最终选择芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA等6种成分进行含量测定。

3.2 检测波长的选择

本研究前期分别对芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA等6种成分进行紫外扫描。结果，芦丁的最大吸收波长为257 nm，山柰酚-3-O-芸香糖苷的最大吸收波长为344 nm，丹参酮ⅡA与隐丹参酮的最大吸收波长为270 nm，二氢丹参酮Ⅰ的最大吸收波长为240 nm，丹参酮Ⅰ的最大吸收波长为245 nm，各成分最大吸收波长各不相同，故选择相差较大的3个波长（245、270、344 nm），对同一供试品进行测定，对基线、分离度、理论板数和各成分含量进行综合评价。结果，在上述波长下检测，各色谱峰均能达到基线分离，分离度均大于1.5，柱效好；在270 nm波长下检测时，各成分含量均较高，故最终选择270 nm作为检测波长。

3.3 流动相的筛选

本研究前期参照2015年版《中国药典》（一部）丹参含量测定项下的流动相[5]，比较了乙腈-水、乙腈-0.02%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液的分离效果。结果，以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相的色谱峰分离度及峰形最好。经反复摸索，本研究最终选定了上述流动相梯度，结果6种成分均能得到较好的分离。

3.4 供试品溶液制备方法的选择

丹参中脂溶性成分主要为菲醌类化合物，槐米中则主要含黄酮类化合物。本研究前期参照2015年版《中国药典》（一部）丹参与槐米药材含量测定项下的方法[5]，采用甲醇超声处理，超声提取液直接进样分析。结果，提取液中成分复杂，呈现出多个色谱峰，且待测成分与相邻色谱峰无法实现基线分离。因此，依据黄酮类、菲醌类化合物与聚酰胺形成氢键缔合而产生吸附的特性，采用聚酰胺柱对供试品进行分离、纯化[18-19]。本研究前期对聚酰胺的用量、色谱柱内径及长度、洗脱剂的种类及用量等进行了筛选。结果发现，选用聚酰胺柱（3 g，30～60目，内径1.2 cm）、以乙醇30 mL进行洗脱时，供试品溶液色谱图中的杂质峰较少，各色谱峰分离度均大于1.5，因此最终选择此法作为本品供试液的制备方法。

3.5 含量测定结果分析

由表4可知，每批成品中黄酮类成分的含量均高于菲醌类成分，均以芦丁含量最高，且芦丁批间差异最小，RSD为0.97%，山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的RSD为2.85%，说明黄酮类化合物较稳定。丹参中4种菲醌类成分含量批间差异较大，尤其是二氢丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅰ（RSD分别为5.02%和9.81%），且丹参酮Ⅰ含量最低。由于不同来源的丹参药材及饮片中丹参酮类成分含量差异明显，因此有必要对丹参的来源进行严格控制。

综上所述，本研究所建立的HPLC法灵敏、快速、操作简便、重复性好，可用于活血促愈胶囊中芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含量的同时测定。