FGF-21对酒精性肝病的保护作用及其机制研究①

杨国灿 刘 琪

(绍兴市人民医院，绍兴312000)

酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是因长期、大量饮用各种含酒精的饮料所致的肝脏损害性病变，主要表现为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝纤维化3种形式[1,2]。酒精性肝病的致病因素单一，即长期大量的酒精摄入。但其发病机制较为复杂，可能与酒精及其代谢产物对肝脏的毒性作用、氧化应激、细胞凋亡、遗传多态性等多种因素有关[3]。成纤维细胞生长因子(FGF)是由20多个成员组成的、具有多种生物功能的一类细胞因子家族[4]。研究表明FGF-21具有内分泌因子的功能，参与机体物质代谢，维持机体脂肪和糖代谢的平衡[5]。本文旨在研究FGF-21对酒精性肝病的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1材料 C57/6小鼠由温州医科大学刘彦隆教授提供。TaqMan®Universal PCR Master Mix(Thermo Fisher)；SuperScriptTMIII cDNA Kit(Invitrogen)；TRIzol Reagent(Invitrogen)；TG kit(北京普利莱基因技术有限公司)；cDNA 第一链合成试剂盒(Invitrogen)。

1.2方法

1.2.1建立ALD小鼠模型 根据文献[6]报道，采用Lieber-DeCarli(PF)饮食配方和酒精(AF)的处理方法喂养C57/6小鼠4周，建立酒精性肝病模型。最后1周注射重组人FGF-21。颈椎脱臼处死小鼠，留取血清，各组小鼠血液中ALT和AST含量均在全自动生化分析仪上检测。取其肝脏组织待用。

1.2.2H&E染色观察各组小鼠肝组织的病理学变化 肝组织于10%中性甲醛中固定，常规方法制作石蜡切片，捞片，烤片；常规脱蜡至水，并进行苏木素染液2 min，盐酸酒精分化30 s，自来水返蓝，伊红染液1 min，蒸馏水洗3 min，乙醇梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，拍照，运用Image-ProPlus6.0软件对图片进行分析。

1.2.3RNA抽提 应用RNeasy Mini试剂盒提取动物组织总RNA。所得RNA即可用于cDNA合成或-80℃短暂保存备用。

1.2.4cDNA合成 应用cDNA第一链合成试剂盒。反应体系:50 μmol/L Oligo(dT)20 1 μl、10 mmol/L dNTP mix 1 μl、总RNA 7 μl、DEPC water 1 μl。轻轻混匀后离心3～5 s，于65℃水浴5 min后，冰上放置1 min，稍微离心后，加入10×RT buffer 2 μl、25 mmol/L MgCl24 μl、0.1 mol/L DTT 2 μl、RNase OUT 1 μl、SuperScript Ⅲ RT 1 μl。轻轻混匀后离心3～5 s，置于50℃水浴50 min；85℃水浴5 min 后，冰上放置1 min，短暂离心后，加入1 μl RNase H；置于37℃水浴20 min后，结束反应，-20℃ 保存备用。

1.2.5Real-time PCR检测小鼠肝脏中PGC-1α的水平 使用TaqMan®Universal PCR Master Mix试剂盒，按照7900HT Real-Time PCR System建立反应体系。内参使用36B4，使用的引物序列如下:PGC-1α-F(5′-AATCAGACCTGACACAAACGC-3′)、PGC-1α-R(5′-GCATTCCTCAATTTCACCAA-3′)、36B4-F(5′-GCAGACAACGTGGGCTCCAAGCAGA-3′)、36B4-R(5′- GGTCCTCCTTGGTGAACACGAAGCCC-3′)。反应条件:95℃预变性10 s，95℃ 5 s，65℃ 20 s，运行40个循环。反应结束后，分析Real-Time PCR扩增曲线及标准曲线，对目的基因进行相对定量分析。

2 结果

2.1脂肪变性及生化指标 H&E染色显示酒精喂养组小鼠肝脏发生明显的脂肪变性，而对照饮食组脂肪变性较轻(图1A)。同时，酒精喂养组小鼠肝脏中TG的含量显著高于对照饮食组(图1B)。我们也检测了各组小鼠血液中ALT和AST含量，酒精喂养组ALT和AST含量显著增高(图1C、D)。

2.2FGF-21降低酒精引起的肝脏脂肪堆积 H&E染色显示酒精喂养组小鼠肝脏发生明显的脂肪变性，而FGF-21注射组脂肪变性程度有所减轻(图2A)。同时，FGF-21注射组小鼠肝脏TG的含量显著低于酒精喂养组(图2B)。

2.3小鼠肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活酶因子1α(PGC-1α)水平的检测 Real-Time PCR检测小鼠肝脏中PGC-1α的水平，如图3所示，酒精喂养组小鼠肝脏中PGC-1α的水平显著高于对照饮食组。

图1 两组生化指标和病理学变化Fig.1 Biochemical parameters and pathological changes of liver tissues were compared between two groupsNote: C57/6 mice fed with Lieber-DeCarli(PF) and alcohol(AF) for 4 weeks.A.H&E staining was used to examine the structure of the liver of each group of mice；B.The liver was collected and the kit was used to detect the TG content in the liver.Peripheral blood was collected and the kit was used to detect the levels of ALT(C)and AST(D) in plasma.*.P<0.05.

图2 FGF-21对酒精引起的脂肪堆积的影响Fig.2 Effect of FGF-21 on alcohol-induced fat accumulationNote: C57/6 mice were fed a Lieber-DeCarli(PF) and alcohol(AF) diet for 4 weeks,and the AF group mice were injected with FGF-21(AF+FGF-21)for the last week.A.H&E staining was used to examine the structure of the liver of each group of mice；B.The liver was collected and the kit was used to detect the TG content in the liver.*.P<0.05.

图3 Real-Time PCR检测小鼠肝脏中PGC-1α的水平Fig.3 Real-Time PCR to detect the level of PGC-1α in mice liverNote: *.P<0.05.

3 讨论

随着国民经济的发展，人民生活水平的提高、生活方式的改变及饮食习惯、饮食结构的改变，我国酒精性肝病的患病率不断增加，已成为肝病结构中主要组成部分。酒精性肝病的致病因素单一，但其发病机制较为复杂。本文通过对比两组小鼠病理和生化结果，并通过检测小鼠肝脏中PGC-1α，探讨FGF-21对酒精性肝病的保护作用及其机制。

Lilly公司的Kharitomenkov证实FGF-21可促进小鼠3T3-L1细胞和前脂肪组织的葡萄糖吸收；FGF-21在过氧化物酶体增生物激活受体PPARα调节下，可以作为肝脏中稳定的脂类调节剂，以避免脂肪肝的发生[7]。腺病毒诱导的FGF-21基因敲除小鼠循环系统中FGF-21的水平显著降低，表现出迅速的脂肪堆积和明显的脂质紊乱。当给予这种基因敲除小鼠高脂饮食喂养时，小鼠可以发生严重的代谢紊乱，包括脂肪肝、高三酰甘油血症、血中的自由脂肪酸和胆固醇的含量显著增加以及血中酮体含量的减少[8]。有研究以C57BL/6J为背景的小鼠制作FGF-21转基因小鼠模型，该小鼠对饮食诱导的肥胖具有明显的抑制作用。该转基因小鼠肝脏中FGF-21 mRNA的水平与对照组正常小鼠相比高出50～150倍，同时血中胆固醇、三酰甘油、血糖和胰岛素的水平显著降低。同时，小鼠血中β-羟丁酸的含量显著增加，同时伴有脂肪组织减少，白色脂肪组织中脂肪酶含量显著增加以及血中自由脂肪酸含量的增加[7]。

目前已有研究表明FGF-21与肝脏疾病存在一定关系。有人报道肝损伤患者外周血中FGF-21水平显著增高并与谷草转氨酶(AST)和谷氨酰转肽酶(GGT)呈相关性[9]。最近三组研究几乎同时报道了非酒精性脂肪肝患者体内FGF-21水平显著增高[10]，其中一组同时检测了肝脏中FGF-21蛋白和mRNA的表达情况，发现FGF-21水平随着肝脂肪变程度的增加而增高[11-14]。动物实验也有相似的结果，高脂流体饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝脏中FGF-21 mRNA显著增高[15]。总之，FGF-21对糖脂代谢的调节具有重要的作用，同时FGF-21是FGFs家族中目前发现的唯一没有促有丝分裂活性的蛋白，从而大大降低了临床用药的风险。这些都表明了它在糖脂代谢性疾病上的治疗效果，也预示了它在人体药物开发中具有重要的应用前景。

PGC-1α是一种介导多种细胞能量代谢和核受体的重要因子，可以辅助激活一系列核受体基因的表达。它通过激活脂肪酸氧化、糖异生、线粒体呼吸的关键酶参与了脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、线粒体损伤的形成[16-19]。

综上所述，给酒精性肝病小鼠注射重组人FGF-21可以显著减轻肝脏的脂肪堆积，改善酒精对肝脏的损伤。PGC-1α可能在FGF-21对酒精性肝病的保护作用及其机制中发挥重要作用，我们将继续研究FGF-21对酒精性肝病以及肝纤维化的药理学作用，探讨FGF-21是否可以逆转酒精性肝病的发展过程，阻止酒精性肝硬化的发生。