NLR、CRP、IL-2、BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b在乳腺癌诊断及预后中的应用

王述莲 呼建民 李绵洋 王成彬

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，由于乳腺癌起病隐匿，早期病变难以发现，约70.0%的乳腺癌患者在首次就诊时已属晚期，使得生存率在30.0%以下[1～3]。现代研究表明肿瘤的发生、发展是一个复杂的过程，是由多因素、多阶段、多步骤共同参与的过程[4，5]。乳腺癌的早期诊断与检测有助于对乳腺癌高危人群进行普查、诊断、鉴别诊断及治疗效果观察，对病情判断与预测预后都有重要的价值[6，7]。C反应蛋白(CRP)、白介素(IL-2)是反映炎症应激作用的常见指标，在乳腺癌患者中多呈现高表达状况。当前中性粒细胞和淋巴细胞绝对值的比值(neutrophil to lymphocyte ratio，NLR)作为评价恶性肿瘤病情与预后的因素也备受关注[8，9]。不过上述指标用于诊断乳腺癌的诊断敏感度和特异性较低，而且极易出现假阳性[10，11]。

我国乳腺癌患者约有8%属于家族性乳腺癌，其中乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)的致病性突变仅为15%左右[12]。微小RNA (microRNA, miRNA)是一类长度为21～24个核苷酸的单链小分子非编码RNA，可与靶基因mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)进行配对结合，可调节mRNA的表达[13]。当前许多与肺癌相关的miRNAs已得到了实验证实，如与肺癌早期诊断相关的miR-145、miR-21、miR-10b等，与正常对照组比较，其在肺癌患者血清中的表达水平均显著升高[14]。本研究探讨了NLR、CRP、IL-2联合标志物(BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b)在乳腺癌诊断及预后中的应用，以期能建立一种有效的诊断乳腺癌与预测预后的方法。现总结报道如下。

资料与方法

1.研究对象:采用回顾性总结研究2016年2月～2018年5月选择在笔者医院诊治的乳腺癌患者60例(癌变组)、良性乳腺肿瘤患者60例(瘤变组)与健康人60例(对照组)。纳入标准：笔者医院伦理学委员会批准了此项研究；所有入选者的临床病例资料完整；都有明确的病理检查结果；患者年龄20～80岁；检测前未接受过手术、激素、放射治疗、化学治疗等治疗；入选者在自愿条件下签署了知情同意书。排除标准：妊娠与哺乳期女性；临床资料与病理学资料缺项者；合并其他系统肿瘤病史；合并心脏、肺、肝脏、胃等重要脏器的疾病。对照组：年龄28～77岁，平均年龄58.33±3.11岁，平均体重指数22.48±1.28kg/m2。瘤变组：患者年龄29～78岁，平均年龄59.11±2.87岁，平均体重指数22.10±2.19kg/m2。癌变组：患者年龄28～77岁，平均年龄58.23±4.11岁，平均体重指数22.83±1.23kg/m2；临床分期：Ⅱ期34例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例；淋巴结转移：无转移45例，有转移15例；分化程度：低分化21例，中分化19例，高分化20例。3组的年龄、体重指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.检测指标与方法：采集所有入选者的空腹肘静脉全血3～6ml，平分为3份，第1份样本采用离心机在4℃ 离心后(3000×g离心10min)，取上清，采用免疫荧光法检测CRP、IL-2水平，检测设备是i400免疫发光检测仪(德国罗氏公司)。第2份样本采用不进行抗凝，采用全自动血液分析仪检测外周血中的血小板、中性粒细胞、淋巴细胞值，计算NLR。第3份样本不进行抗凝，提取血液基因组DNA与RNA，采用实时PCR检测总RNA中miR-145、miR-21、miR-10b含量。miR-145引物为5′-CATCTTACTGGGCAGCATYGGA-3′，miR-21引物为5′-CGT-CTTTACCCAGCAGTGT-3′，miR-10b引物为5′-ATCGAAAGTACTGGACTTT-3′。采用实时PCR检测总DNA中的BRCA1表达水平，BRCA1引物为5′-ATTTGGCCTAGCTCCTAA-3′。PCR过程：95℃ 10min酶活化，后续40个循环，95℃ 15s，延伸60℃ 1min，60～95℃下进行溶解曲线分析，以Ct值≤27为阳性。

3.随访方式:随访采用电话、信访相结合的方式，了解癌变组患者的生存情况。

结 果

1.CRP与IL-2水平比较:癌变组的血清CRP、IL-2水平高于瘤变组与对照组，瘤变组高于对照组(P<0.05),详见表1。

表1 3组血清CRP与IL-2水平比较

与瘤变组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

2.NLR值比较:癌变组的NLR值低于瘤变组与对照组，瘤变组低于对照组(P<0.05),详见表2与图1。

表2 3组NLR值比较

与瘤变组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

图1 3组NLR值比较

3.BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b阳性率比较:癌变组血液中BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b阳性率高于瘤变组与对照组(P<0.05),详见表3。

表3 3组血液BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b阳性率比较 [n(%)]

与瘤变组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

4.随访预后:随访至今，癌变组中患者死亡6例，存活54例，病死率为10.0%。

5.乳腺癌临床指标与临床病理特征、治疗预后的相关性:癌变组60例患者中，随着淋巴结转移、分化程度减少、病理分期增加与随访死亡，BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b表达阳性率显著增加(P<0.05),详见表4。

6.影响因素分析:在癌变组60例患者中，以预后死亡作为因变量，以检测指标与病理学特征为自变量，多因素Logistic回归分析淋巴结转移、临床分期、组织学分化、BRCA1、miR-145、miR-21都为影响患者预后死亡的主要独立危险因素(P<0.05),详见表5。

表4 乳腺癌临床指标与临床病理特征、治疗预后的相关性[n(%)]

表5 影响乳腺癌患者预后的影响因素 (n=60)

讨 论

乳腺癌是目前最常见的女性恶性肿瘤之一，发生率在我国逐渐增加。特别是很多患者早期症状隐匿，缺乏有效的敏感而特异的早期诊断方法，多数的患者就诊时已是晚期，预后比较差。当前乳腺癌的病因尚不十分清楚，其中经历了多步骤、多阶段、多因素、多基因变异参与的复杂的生物学演变过程，发病机制非常复杂[15]。

CRP是由肝细胞分泌合成的急性期反应蛋白，IL-2是免疫细胞分泌的重要炎性反应标志物之一。正常情况下，血液中的CRP、IL-2水平较低，当机体出现炎症或恶性肿瘤时，血液中的CRP、IL-2水平会显著上升[16]。本研究显示，癌变组的血清CRP、IL-2水平高于瘤变组与对照组，瘤变组高于对照组(P<0.05)，表明两者可以作为乳腺癌的一种诊断指标，其主要作用机制与肿瘤的发生、发展密切相关。中性粒细胞分泌大量的血管内皮生长因子，刺激毛细血管增生，有助于肿瘤细胞的生长及转移；其也可产生活性氧和细胞因子杀伤肿瘤细胞[17]。并且淋巴细胞参与机体的免疫反应，可直接杀伤肿瘤细胞；淋巴细胞减少提示机体抗肿瘤免疫力下降，为肿瘤提供生长环境。本研究显示癌变组的NLR值低于瘤变组与对照组，瘤变组低于对照组(P<0.05)。从机制上分析，随着肿瘤的发生、进展，机体炎症与抗肿瘤之间失去平衡，可降低NLR降低；同时炎性反应可刺激肿瘤分化，从而促进肿瘤的增殖，形成一种恶性循环[18]。

近年来，随着分子遗传学和分子生物学的研究与不断发展，当前许多研究者越来越深入对乳腺癌在分子水平致癌机制进行了研究。相关研究表明BRCA1的表观丢失或表达位置变化可能造成散发性乳腺癌的发生。BRCA1属抑癌基因，可以通过p53促使细胞周期抑制因子p21的表达；BRCA1蛋白还能快速定位并通过同源重组和非同源末端连接等途径修复损伤DNA，阻止受损细胞进入下一周期以调控细胞周期[19]。相关研究表明BRCA1的甲基化和相关突变导致BRCA1蛋白表达下调时，对细胞周期的调控及抑癌作用减弱，可促使肿瘤的发生与发展[20]。miRNA与肿瘤的发生、发展密切相关，miRNA可通过靶向调控多种靶基因及信号通路影响肿瘤的发生、发展。当前包括乳腺癌在内的许多肿瘤组织中均可发现miRNA表达失调的现象，如肺癌、胃癌、肠癌等。比如miR-145、miR-21、miR-10b可通过多种信号转导途径而参与肿瘤的发生和发展，但是具体的机制还不明确。本研究显示癌变组血液中BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b阳性率高于瘤变组与对照组(P<0.05)。相关研究表明miRNA还可以促进免疫活性介质的释放来参与肿瘤的免疫调控，miR-21、miR-10b可下调肿瘤细胞表面的细胞内黏附分子-1的表达水平，从而降低机体的免疫功能；miR-145可以阻碍了免疫系统对肿瘤细胞的识别能力[21]。

炎症抑制与血常规指标能在一定程度上反映出乳腺癌患者的病情，但是预测预后的价值有限。本研究随访至今，癌变组中患者死亡6例，存活54例，病死率为10.0%；随着淋巴结转移、分化程度减少、病理分期增加与随访死亡，BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b表达阳性率显著增加(P<0.05)。有研究显示乳腺癌患者NLR水平≥3～4时与高复发危险和高病死率相关，治疗前乳腺癌患者NLR水平升高其预后较差[22]。BRCA1基因突变的乳腺癌患者具有独特的临床病理，BRCA1阴性家族性乳腺癌患者具有较低的肿瘤分级。文献报道miR-145、miR-21、miR-10b可能参与了肿瘤细胞中PI3K途径的激活；miR-10b可能通过影响乳腺癌MCF-7细胞的增殖、凋亡及周期分布而发挥促癌作用[23]。

BRCA1与肿瘤的恶性程度、肿瘤侵袭性、复发性、转移、大小等密切相关，在散发型乳腺癌中约30%的患者伴有BRCA1表达水平升高，肿瘤直径越大、临床分期越晚、组织学级别越高，BRCA1蛋白表达率越高。本研究多因素Logistic回归分析淋巴结转移、临床分期、组织学分化、BRCA1、miR-145、miR-21都为影响患者预后死亡的主要独立危险因素(P<0.05)。 miRNAs在乳腺癌的血管生成方面也发挥了重要作用，丰富的miRNAs可影响并修饰基质细胞，募集肿瘤相关的基质细胞，从而促进肿瘤的发生与进展。不过任何单一的指标对检测乳腺癌的效果都不能十分满意，而指标的联合检测有助于提高乳腺癌的早期诊断准确率。

综上所述，NLR、CRP、白介素-2联合BRCA1、miR-145、miR-21、miR-10b在乳腺癌中呈现异常表达情况，与乳腺癌的病理特征与随访预后密切相关，可应用乳腺癌辅助诊断与预后预测。