通阳利湿方对腰椎间盘突出症大鼠的影响

程 杰, 王 鹏, 关胜江, 赵 建, 张春旭, 赵 倩, 张裕翔

(河北省中医院,河北 石家庄050000)

腰椎间盘突出症是当今社会常见病、多发病,也是引起腰腿痛最常见的原因,其临床症状大多因腰椎间盘退变、纤维环破裂、髓核向后方突出或突至椎板内,致使相邻组织受刺激或压迫而出现,以L4-5、L5-S1间隙发病率最高［1］。腰椎间盘突出症急性期疼痛剧烈,腰椎功能严重受限,极大影响了患者生存质量,如果治疗不当转为慢性,则病情反复发作,迁延难愈。

该疾病属于中医“腰腿痛” “痹证” 范畴［2］。通阳利湿方是河北省中医院名中医赵建教授在多年临床经验基础上确定的方剂,由黄芪、桂枝、木瓜、蚕沙、白芍、白术、茯苓等成,具有补阳通脉、运化水湿功效,在临床使用多年,疗效显著,但作用机制不明。因此,本实验从抑制炎症因子、调节细胞外基质合成角度考察通阳利湿方对腰椎间盘突出模型大鼠的影响,以期为治疗该疾病提供科学依据。

1 材料

1.1 药物 通阳利湿方由黄芪、桂枝、木瓜、蚕沙、白芍、白术、茯苓、青风藤、泽泻、苦杏仁、丝瓜络、汉防己、桑枝、薏苡仁、狗脊、怀牛膝、路路通、酒大黄、独活、姜黄、威灵仙组成,药材购自河北省中医院,经国药乐仁堂石家庄药材有限公司专家鉴定为正品,制备方法为头煎加800 mL 水,煎至300 mL 滤出,然后加500 mL 水煎至300 mL,滤出,两煎相兑后浓缩到最浓。阳性药为腰痛宁胶囊(颈复康药业集团有限公司,生产批号620153,0.3 g/粒),内容物用0.5%羧甲基纤维素钠溶解,配制0.02 g/mL 混悬液。注射用青霉素钠(哈药集团制药总厂,生产批号16121205-1),160 万单位/支。

1.2 动物 SPF 级雄性SD 大鼠70 只,体质量180～200 g,由河北医科大学实验动物中心提供,实验动物使用许可证号SYXK(冀)2013-1-003,动物合格证号1705188,饲养于实验动物屏障系统中,自由进食灭菌鼠粮和摄取重蒸水,人工照明(12 h 黑暗/12 h 光照),保持温度20～25 ℃,湿度(55±5)%。

1.3 试剂 肿瘤坏死因子(TNF-α) (批号C06PZB)、白细胞介素1β(IL-1β) (批号C09PDB)、白细胞介素6(IL-6) (批号C12PDB) 试剂盒均购自于北京北方生物技术研究所；RT-PCR 试剂盒购自宝生物工程(大连) 有限公司；Trizol 购自美国Invitroge 公司。PCR 引物序列为成纤维细胞生长因子2(FGF-2) 正向5′-CGAACCGGTACCTGGCTATG-3′,反 向5′-ACTGCCCAGTTCGTTTCAGT-3′, 预 扩 增 片 段162 bp；基质金属蛋白酶2(MMP-2) 正向5′-AGCAAGTAGACGCTGCCTTT-3′, 反 向 5′-CAGCACCTTTCTTTGGGC AC-3′,预扩增片段469 bp；GAPDH 正 向5′-AGGAAATGATGACCTCCTGAACT-3′,反向5′-CAGGCATTGTCTGAGAG GCA-3′,预扩增片段605 bp。

1.4 仪器 756MC 型紫外-可见分光光度计,购自上海精密科学仪器有限公司；PE9600 型PCR 扩增仪,购自美国PE 公司；电泳仪、电泳槽,购自北京六一仪器厂；MDF-382E 超低温保存箱,购自日本SANYO 公司；1-15K 高速冷冻离心机,购自美国Sigma 公司；ASB240 生物信号采集系统,购自重庆生物科技技术有限公司。

2 方法

2.1 模型制备［3］大鼠适应性饲养3 d 后禁食12 h,腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg) 麻醉,俯卧位固定,距肛门1 cm 处扎紧尾部,将结扎处远心端的尾部切下,压迫止血并缝合,将尾椎关节椎间盘组织中乳白色胶冻样髓核组织取出,合并后备用,背部手术区碘伏消毒,备皮,切开皮肤(长约3 cm),从左侧棘突上将L5,6段腰椎钝性分离,暴露横突,咬除横突及其附带的椎板,切除左侧部分L5,6段的椎板和上下关节突,将大鼠自体尾椎髓核组织(约10 mg) 植入左侧L5神经根出硬膜囊的交界处,对于神经根及硬膜囊不造成压迫,逐层缝合组织；假手术组大鼠除不植入髓核外,其余操作同模型大鼠。造模完成后,各组大鼠每天肌肉注射青霉素钠(1.6 万单位)1 次,连续3 d。

2.2 分组与给药 将造模成功的大鼠按照初始痛阈值随机分为5 组,分别为模型组、腰痛宁胶囊组(混悬液0.2 g/kg,根据不同动物等效剂量的折算系数表计算,相当于临床等效剂量)、通阳利湿方组(60、30、15 g/kg) (依据课题组前期预实验,进行剂量探索而定),每组10 只,另设假手术组大鼠10 只。造模成功3 d 后,各组大鼠按照10 mL/kg 剂量灌胃给药(或蒸馏水),连续30 d。

2.3 指标测定

2.3.1 机械压痛痛阈值 初次给药前和末次给药后1 h,将各组大鼠放入固定器内,左后肢暴露于外,待其安静后将左后肢置于压痛仪上测定痛阈值。

2.3.2 血清TNF-α,IL-1β、IL-6 水平 末次给药后,各组大鼠禁食12 h,腹腔注射水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,30 min 内分离血清,ELISA 法测定血清中TNF-α,IL-1β 及IL-6 水平。

2.3.3 椎间盘组织FGF-2、MMP-2 mRNA 表达 采用RTPCR 法。分离、剥取大鼠腰椎间盘组织,置于-80 ℃冰箱保存,取大鼠椎间盘组织100 mg 左右,置于匀浆器中,加适量RNAiso Plus,匀浆器匀浆后提取总RNA,将其反转录成cDNA,进行PCR 扩增。FGF-2 扩增条件为94 ℃预变性3 min,94 ℃变性40 s,54 ℃退火50 s,72 ℃延伸90 s,共30 个循环,72 ℃延伸10 min；MMP-2 扩增条件为52 ℃退火50 s,其余同FGF-2；GAPDH 扩增条件为55 ℃退火50 s,其余同FGF-2。取每个标本PCR 产物各6 μL,在含1%GV 核酸染料的琼脂糖凝胶中电泳,以DNA Marker(DL2000) 为标准片段标记,电泳后以紫外透射仪观察并拍照,采用Quantity One 图像分析系统分别检测各组FGF-2、MMP-2、GAPDH 电泳条带灰度值,将两者与GAPDH比值为mRNA 相对表达。

2.4 统计学分析 通过SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析,数据以() 表示,组间比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 通阳利湿方对大鼠机械压痛痛阈值的影响 表1 显示,模型组、腰痛宁胶囊组、通阳利湿方组大鼠初始痛阈值均显著低于假手术组(P＜0.05,P＜0.01),而模型组大鼠最终痛阈值显著低于假手术组(P＜0.01)；与模型组比较,通阳利湿方组大鼠最终痛阈值显著升高(P＜0.05),并且60、30 g/kg 组痛阈增加值显著增加(P＜0.05,P＜0.01),但15 g/kg 组无显著性差异(P＞0.05)。

表1 通阳利湿方对大鼠机械压痛痛阈值的影响（n=10）

表1 通阳利湿方对大鼠机械压痛痛阈值的影响（n=10）

注：与模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01；与假手术组比较,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

组别 剂量/(g·kg-1) 初始痛阈值/g 最终痛阈值/g 痛阈增加值/g假手术组 — 345.1±111.2** 468.9±91.8** 123.3±103.7模型组 — 214.0±65.2＃＃ 272.5±81.6＃＃ 58.5±21.3腰痛宁胶囊组 0.2 240.9±61.1＃＃ 421.8±149.5** 180.9±108.3**通阳利湿方组 60 247.4±79.1＃＃ 405.0±139.0* 157.6±79.2**通阳利湿方组 30 266.8±76.4＃ 394.9±120.7* 128.1±63.0*通阳利湿方组 15 268.3±72.7＃ 391.2±100.2* 122.9±54.2

3.2 通阳利湿方对TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的影响 表2显示,模型组TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均较假手术组显著升高 (P ＜0.01)。 与模型组比较, 通阳利湿方 (60、30 g/kg) 组TNF-α、IL-1β 水平显著降低(P＜0.05),但15 g/kg 组无显著差异(P＞0.05)；通阳利湿方(60 g/kg)组IL-6 水平显著降低(P＜0.05),而30、15 g/kg组虽无显著差异(P＞0.05),但也呈现降低趋势。

表2 通阳利湿方对TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的影响n=10）

表2 通阳利湿方对TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的影响n=10）

注：与模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01

组别 剂量/(g·kg-1) TNF-α/(ng·mL-1) IL-1β/(ng·mL-1) IL-6/(pg·mL-1)假手术组 — 0.85±0.35** 0.17±0.02** 87.8±23.2**模型组 — 1.29±0.16 0.32±0.10 134.2±40.8腰痛宁胶囊组 0.2 1.02±0.23* 0.21±0.07** 98.8±40.1*通阳利湿方组 60 1.05±0.20* 0.22±0.05* 101.9±34.0*通阳利湿方组 30 1.06±0.28* 0.24±0.11* 108.3±30.7通阳利湿方组 15 1.25±0.15 0.25±0.11 113.9±29.8

3.3 通阳利湿方对FGF-2、MMP-2 mRNA 表达的影响 表3、图1 显示,模型组FGF-2、MMP-2 mRNA 表达较假手术组显著升高(P＜0.01)；与模型组比较,通阳利湿方组两者mRNA 表达显著降低(P＜0.01)。

表3 通阳利湿方对FGF-2、MMP-2 mRNA 表达的影响n=10）

表3 通阳利湿方对FGF-2、MMP-2 mRNA 表达的影响n=10）

注：与模型组比较,**P＜0.01

组别 剂量/(g·kg-1) FGF-2 MMP-2假手术组 — 0.264±0.016** 0.251±0.136**模型组 — 0.638±0.019 0.630±0.025腰痛宁胶囊组 0.2 0.376±0.027** 0.311±0.053**通阳利湿方组 60 0.379±0.056** 0.389±0.055**通阳利湿方组 30 0.444±0.020** 0.394±0.018**通阳利湿方组 15 0.554±0.026** 0.538±0.013**

图1 各组FGF-2、MMP-2 mRNA 表达

4 讨论

随着我国进入到老龄化社会的进程,腰椎间盘突出症已经成为临床常见病和多发病,主要表现为反复腰痛和坐骨神经痛,对患者工作和生活影响极大。国内外文献报道腰椎间盘突出症在急性期时,西医大多以20%甘露醇、甘油、果糖等进行治疗,此类渗透性脱水剂静脉滴注后能迅速提高血浆渗透压,使组织水分向血浆转移,产生脱水作用,该疗法效果虽好,但多次输注可引起部分患者静脉受损,加重组织损伤,局部出现皮肤发红、肿胀、疼痛,致血栓性静脉炎等发生,甚至引起无菌性炎症、坏死、溃烂,这些不良反应限制了其应用时间,而且患者耐受性差。

中医并无腰椎间盘突出症,该病属“腰腿痛” “痹证”范畴,一般分为寒湿型、湿热型、血瘀型、肝肾亏虚型等,对其大多采用活血化瘀、补益肝肾的治法,起效较慢。河北省中医药名老中医赵建教授受西医脱水剂治疗腰椎间盘突出症疗效理想的启发,通过大量临床观察发现急性期患者大多有湿邪留滞经络、阻遏阳气调达的表现,据此确立了一个新的证型——湿阻阳遏型,并提出治疗法则——通阳利湿法,以融解滞涩于腰部经络的水湿,以及水湿日久所化的瘀滞之邪,通行阳气以四部条达,自拟通阳利湿方。方中君药黄芪、桂枝、狗脊,补阳通脉；白芍、白术、茯苓、泽泻为臣药,其中白芍与桂枝合《伤寒论》 桂枝汤之意,疏解太阳经之痹,太阳融雪；茯苓、猪苓、白术、泽泻与桂枝共用,暗合五苓散、苓桂术甘汤方义,健运脾阳使水湿得以运化,温煦肾阳来气化阴邪；苦杏仁、粉防己、白芍、薏苡仁亦为臣药,意在调脏腑之气,其中苦杏仁提壶揭盖,宣启肺之上源,粉防己肃泄肺之雍闭,薏苡仁淡渗中焦之湿,白芍畅肝解郁；酒军为佐,制约黄芪、桂枝、狗脊、威灵仙之热性；通经之药蚕沙、桑枝、丝瓜络、青风藤、路路通为佐,通利经络之风寒湿之痹邪；独活、威灵仙、怀牛膝、木瓜为使,是为引经,其中独活善入膀肌经下部,威灵仙通行十二经, “牛膝行到膝,木瓜行到底”,引方中诸药以达病所,以上诸药合用,能通达四脏一腑之阳气,利行滞涩之湿瘀,共奏通阳利湿之功。

前期课题组已证实,通阳利湿方对醋酸所致小鼠扭体反应有良好的镇痛作用,对大鼠棉球肉芽肿也有抑制作用。本实验采用大鼠自身尾椎髓核移植入腰椎神经根复制腰椎间盘突出症模型,并检测大鼠左后肢机械压痛痛阈值,发现模型组大鼠痛阈值明显低于假手术组,证实髓核突出可引起大鼠痛敏感反应,与文献［4］ 报道一致；给予通阳利湿方后,大鼠左后肢机械压痛痛阈值明显增加,表明该方对痛敏感有良好的改善作用。

关于引起腰椎间盘突出症痛觉过敏的原因众说纷纭,传统观点认为与髓核机械压迫有关［5］；也有学者研究发现,髓核引起自身免疫反应所致的神经根炎症是引起神经根症状的主要原因［6］；现代医学普遍认为,椎间盘组织突出区域的细胞能合成和分泌TNF-α、IL-1β、IL-6 等多种炎性介质,均与退变程度密切相关［7］,其中高水平TNF-α 可促进I 型胶原合成的增加,并逐步取代II 型胶原而进一步发展成椎间盘纤维化［8］,而大量分泌的TNF-α 又通过诱导产生IL-1β、IL-6 等来加速了骨吸收,促进了破骨细胞的增殖和分化,进而引起骨量减少,骨组织结构退变,通过破坏骨质促进腰椎间盘退变［7］,此外TNF-α、IL-1β 还能促进PGE2等致痛介质释放,对神经根有直接刺激作用,并能增强其对缓激肽的敏感性,故与LDH 的疼痛密切相关［5,9］；临床研究也证实,腰椎间盘突出症患者椎间盘组织中TNF-α、IL-1β、IL-6 表达显著增加［10］,髓核组织的炎性细胞浸润时TNF-α 和IL-1β 大量分泌,会引起MMPs 分泌增加［11］。

炎症反应主要通过激活蛋白激酶来引起细胞外基质内蛋白成分水解,造成细胞外基质降解,而髓核组织中细胞外基质最主要的成分为多种类型的胶原。MMP-2 能水解Ⅳ型和Ⅴ型胶原,进而造成髓核发生退行性病变［12-13］,临床研究显示腰椎间盘突出症患者椎间盘组织中其蛋白量明显高于对照组,证实该疾病发生与MMP-2 水平增高,并引起细胞外基质丢失有关［14］。在椎间盘退变过程中,可代偿性地引起软骨组织增生和细胞外基质合成增加,表现为组织中FGF-2 及其受体mRNA 表达明显增加［15］。鉴于此,本实验主要通过分析炎症因子水平及MMP-2、FGF-2 mRNA 表达,探究通阳利湿方改善腰椎间盘突出症的作用机制,发现该方能明显降低大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平,下调组织MMP-2、FGF-2 mRNA 表达,推测可能与抑制炎症因子,调节细胞外基质合成有关。