黄芪总黄酮对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的影响

李 艳, 伊 航, 蔡轶伦, 林红艳, 刘还秀

(武汉理工大学医院外科,湖北 武汉430070)

肝纤维化是一种常见的肝脏病理变化,随着中国快速进入老龄化,其发病率和检出率逐年升高,已成为引起老年人慢性肝脏损害的主要病因之一［1］。当肝脏受到病毒感染、酒精、药物等生化因素损伤时,在多种细胞因子共同作用下肝星状细胞活化,并转变为肌成纤维细胞,同时合成过多胶原蛋白,使大量细胞外基质在肝脏内堆积,从而引发肝纤维化,最终演变为肝硬化。近期研究发现,转化生长因子-β1(TGF-β1) 是目前已发现的最强的促肝纤维化因子,可通过Smad 蛋白转导信号,进而活化肝星状细胞,并促使其大量分泌胞外基质,促进肝纤维化发生进展［2-3］。由于肝纤维化存在逆转可能,实现对这一阶段的调控对于肝硬化及其并发症的防治具有极为重要的临床意义。

黄芪为我国传统的补益中药,现代药理研究发现它可调节神经系统,而且抗炎、抗衰老效果明显［4］。黄芪总黄酮是黄芪主要活性成分,但鲜有关于其抑制肝纤维化作用的研究报道,故本实验探究该成分对大鼠肝纤维化的影响,并从TGF-β1/Smad 信号通路角度研究其可能的作用机制。

1 材料

雄性SD 大鼠,6～8 周龄,体质量180～220 g,购自湖南斯莱克景达动物有限公司。CCl4购自广东汕头西陇化工有限公司。黄芪总黄酮(批号ZL150206582)购于南京春秋生物工程有限公司,含有量90.2%；秋水仙碱片购于西双版纳药业有限责任公司,批号160917。苏木精-伊红(HE) 染液购自北京百灵威科技有限公司；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST) 试剂盒购自上海科华东菱诊断用品有限公司；透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC Ⅲ)、Ⅳ型胶原(C Ⅳ)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 酶联免疫吸附试验(ELISA) 试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；β-平滑肌肌动蛋白(β-actin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGF-β1、Smad3、Smad4 抗体购自美国Santa Cruz 公司；放射免疫沉淀检测(RIPA) 裂解液、二喹啉甲酸(BCA) 试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDSPAGE) 凝胶试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

2 方法

2.1 分组、造模及给药［5］65 只大鼠适应性喂养1 周后,随机分为正常组、模型组、阳性组(秋水仙碱,50 mg/kg)和黄芪总黄酮低、中、高剂量组(25、50、100 mg/kg),其中模型组15 只,其他组均10 只。除正常组外各组大鼠均腹腔注射含40%CCl4的花生油溶液 (3 mL/kg,首次5 mL/kg),每周2 次,共8 周。从造模第1 天起开始给药,每天1 次, 正常组、 模型组大鼠灌胃给予双蒸水(10 mL/kg), 阳性组、 黄芪总黄酮组给予相应药物(10 mL/kg),直至实验结束。

2.2 指标检测 8 周后,大鼠腹腔注射10%水合氯醛(10 mL/kg) 麻醉,采集腹主动脉血液,室温放置下2 h 后4 500 r/min 离心15 min,吸取上层血清,-20 ℃下保存,生化法或ELISA 法检测血清ALT、AST 活性及HA、LN、PC Ⅲ、C Ⅳ、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。摘取大鼠肝右叶,切取相同位置肝组织,置于4%多聚甲醛中固定,24 h后经梯度脱水、透明、石蜡包埋、切片、苏木精染色、分化、返蓝、伊红染色等标准操作后,采用中性树胶封片,光学显微镜下观察肝组织病理变化。将剩余大鼠肝右叶冻存于-80 ℃中,精密称取大鼠肝组织100 mg,RIPA 裂解液充分研磨后,BCA 试剂盒测定蛋白浓度,SDS-PAGE 凝胶分离蛋白,每孔蛋白上样量为30 μg,蛋白分离后转移至PVDF 膜,分别加入β-actin (1 ∶1 000)、 α-SMA (1 ∶1 000)、 TGF-β1 (1 ∶ 500)、 Smad3 (1 ∶ 800)、 Smad4(1 ∶1 000) 抗体稀释液孵育过夜,加入山羊抗兔或山羊抗鼠辣根酶标记二抗(1 ∶5 000) 稀释液,室温下孵育2 h,胶片曝光后通过ImageJ 软件分析蛋白灰度,计算目的蛋白相对表达量。

2.3 统计学分析 通过Graphpad Prism 5.0 软件进行处理,结果以表示,多组间比较采用单因素方差分析,2组间比较采用独立样本t 检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 黄芪总黄酮对肝组织病变的影响 图1 显示,正常组大鼠肝细胞以中央静脉为中心,呈放射状排列,未见肝细胞坏死、纤维增生、炎性浸润；模型组大鼠肝细胞呈片状坏死,炎性细胞浸润明显,肝细胞索结构紊乱,并形成大量纤维结缔组织,肝窦界限模糊,肝细胞结构完全被破坏；阳性组、黄芪总黄酮组大鼠病变明显轻于模型组,肝细胞坏死、炎性细胞浸润明显减少,胶原纤维增生明显减轻。

图1 黄芪总黄酮对大鼠肝组织病变的影响（×400）

3.2 黄芪总黄酮对ALT、AST 活性的影响 表1 显示,与正常组比较,模型组ALT、AST 活性显著升高(P＜0.01)；与模型组比较,黄芪总黄酮组两者活性显著降低(P＜0.01)。

3.3 黄芪总黄酮对HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平的影响 表2 显示,与正常组比较,模型组HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平显著升高(P＜0.01)；与模型组比较,黄芪总黄酮中、高剂量组四者水平显著降低(P ＜0.01),而低剂量组LN、PCⅢ、CⅣ水平显著降低(P＜0.05,P＜0.01),HA 水平无显著变化(P＞0.05)。

表1 黄芪总黄酮对大鼠血清ALT、AST 活性的影响

表1 黄芪总黄酮对大鼠血清ALT、AST 活性的影响

注：与正常组比较,**P＜0.01；与模型组比较,＃＃P＜0.01

组别 动物数/只 ALT/(U·L-1) AST/(U·L-1)正常组 10 36.49±4.65 48.20±5.73模型组 13 179.57±20.62** 219.75±25.43**阳性组 10 124.19±14.57＃＃ 166.87±19.08＃＃黄芪总黄酮低剂量组 10 151.74±17.94＃＃ 176.49±18.61＃＃黄芪总黄酮中剂量组 10 138.84±14.49＃＃ 154.88±17.85＃＃黄芪总黄酮高剂量组 10 107.66±9.82＃＃ 133.57±12.54＃＃

表2 黄芪总黄酮对大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平的影响

表2 黄芪总黄酮对大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平的影响

注：与正常组比较,**P＜0.01；与模型组比较,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

组别 动物数/只 HA/(ng·mL-1) LN/(ng·mL-1) PCⅢ/(ng·mL-1) CⅣ/(ng·mL-1)正常组 10 187.66±21.86 77.26±9.61 54.39±6.20 17.63±2.38模型组 13 239.67±25.51** 196.57±22.64** 97.62±11.67** 67.51±6.27**阳性组 10 212.59±23.67＃ 153.49±17.22＃＃ 81.06±10.37＃＃ 52.78±6.93＃＃黄芪总黄酮低剂量组 10 219.43±24.79 176.64±16.37＃ 83.39±11.64＃＃ 48.62±5.13＃＃黄芪总黄酮中剂量组 10 208.65±22.67＃＃ 165.09±17.62＃＃ 78.29±8.14＃＃ 39.18±4.22＃＃黄芪总黄酮高剂量组 10 195.43±20.09＃＃ 148.53±13.08＃＃ 71.28±9.36＃＃ 31.56±4.73＃＃

3.4 黄芪总黄酮对IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影响 表3显示,与正常组比较,模型组IL-1β、IL-6、TNF-α 水平显著升高(P＜0.01)；与模型组比较,黄芪总黄酮中、高剂量组三者水平显著降低(P ＜0.01),而低剂量组IL-1β、IL-6 水平显著降低(P＜0.05,P＜0.01),TNF-α 水平无显著变化(P＞0.05)。

表3 黄芪总黄酮对大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影响

表3 黄芪总黄酮对大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影响

注：与正常组比较,**P＜0.01；与模型组比较,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

组别 动物数/只 IL-1β/(pg·mL-1) IL-6/(pg·mL-1) TNF-α/(pg·mL-1)正常组 10 13.46±2.73 19.54±2.17 59.62±7.11模型组 13 35.47±4.28** 44.61±5.09** 159.66±17.92**阳性组 10 29.64±4.78＃＃ 36.24±4.50＃＃ 137.49±15.49＃＃黄芪总黄酮低剂量组 10 31.62±4.21＃ 37.08±3.27＃＃ 149.65±16.57黄芪总黄酮中剂量组 10 26.67±3.38＃＃ 34.19±4.65＃＃ 134.08±14.18＃＃黄芪总黄酮高剂量组 10 22.19±3.08＃＃ 29.55±4.06＃＃ 128.84±13.21＃＃

3.5 黄芪总黄酮对肝组织TGF-β1/Smad 信号通路的影响

表4 显示,与正常组比较,模型组α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad4 蛋白表达显著增加(P＜0.01)；与模型组比较,黄芪总黄酮中、高剂量组四者蛋白表达显著降低(P＜0.01),而低剂量组α-SMA、TGF-β1、Smad4 蛋白表达显著降低(P＜0.05,P＜0.01),Smad3 蛋白表达无显著变化(P＞0.05)。

表4 黄芪总黄酮对大鼠肝组织TGF-β1/Smad 信号通路的影响

表4 黄芪总黄酮对大鼠肝组织TGF-β1/Smad 信号通路的影响

注：与正常组比较,**P＜0.01；与模型组比较,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

组别 动物数/只 α-SMA/β-actin TGF-β1/β-actin Smad3/β-actin Smad4/β-actin正常组 10 0.267±0.031 0.457±0.052 0.308±0.049 0.212±0.028模型组 13 0.682±0.074** 0.963±0.083** 0.764±0.087** 0.719±0.083**阳性组 10 0.468±0.052＃＃ 0.648±0.071＃＃ 0.564±0.063＃＃ 0.527±0.061＃＃黄芪总黄酮低剂量组 10 0.496±0.038＃＃ 0.729±0.086＃＃ 0.674±0.078 0.596±0.067＃黄芪总黄酮中剂量组 10 0.417±0.057＃＃ 0.656±0.073＃＃ 0.593±0.068＃＃ 0.516±0.069＃＃黄芪总黄酮高剂量组 10 0.384±0.033＃＃ 0.609±0.054＃＃ 0.554±0.059＃＃ 0.483±0.055＃＃

4 讨论

从生物学角度来看,肝纤维化是机体对肝损伤的自我修复反应,但若各种因素所致肝损伤得不到有效缓解,长期发展可致细胞外基质过度沉积,致使肝内纤维结缔组织异常增生,破坏肝脏正常组织学结构［6］,并且它也是肝硬化早期阶段,如果得不到有效控制或逆转将可恶化为不可逆的肝硬化［7］,目前肝纤维化尚无临床特效药,中药活性成分是筛选相关药物主要途径之一［8］。黄芪水提物能有效抑制酒精［9］等引起的小鼠急性肝损伤,并且黄芪水提物［10］、总皂苷［11］、多糖［12］等可有效抑制肝纤维化,同时黄芪总黄酮能缓解四环素诱导的肝毒性［13］,但尚无它对肝纤维化作用的报道。因此,本实验通过CCl4建立大鼠肝纤维化模型,研究黄芪总黄酮抗纤维化作用,并探讨其可能的作用机制。

ALT、AST 活性是临床评价肝损伤的主要指标,而HA、LN、PCⅢ、CⅣ是肝脏纤维组织主要基质成分,其血清水平可反映肝纤维化严重程度［14］。本实验发现,模型组大鼠血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ活性或水平明显升高,表明CCl4可引起大鼠肝组织损伤及肝纤维化；黄芪总黄酮干预后可明显降低上述指标活性或水平,并减轻大鼠肝细胞坏死和纤维组织沉积程度,表明该成分能有效抑制CCl4诱导大鼠肝纤维化。

IL-1β、IL-6、TNF-α 是机体重要促炎因子,能造成肝细胞大量死亡,破坏肝组织结构,是肝脏炎症反应的关键炎症因子,三者血清水平可用于评价肝损伤或肝纤维化炎症反应程度［15］。本实验发现,CCl4能引起血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明显增加,而黄芪总黄酮干预可明显抑制三者水平,提示该成分抗纤维化作用可能与抑制炎症反应相关。

TGF-β1 是目前已发现的最强促肝纤维化因子,可通过Smad 蛋白转导信号进而活化肝星状细胞,并促使其大量分泌胞外基质,该过程是肝纤维化发生、进展,甚至肝硬化形成的核心,故抑制TGF-β1/Smad 信号通路是缓解肝纤维化的关键［16］；α-SMA 是肝星状细胞活化程度的特异性标志物,同时也可反映肝纤维化进展程度［17］。本实验发现,肝纤维化大鼠肝组织α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad4 蛋白表达均明显上调,表明肝细胞中TGF-β1/Smad 信号通路被激活,从而促进肝纤维化进程,而黄芪总黄酮可明显抑制该信号通路激活。

综上所述,黄芪总黄酮能有效抑制CCl4诱导大鼠肝纤维化,其作用机制可能与抑制炎症反应和TGF-β1/Smad 信号通路有关。本实验可为黄芪总黄酮开发成抗肝纤维化药物提供理论依据,但还需进一步通过分子生物学实验深入探讨该成分抗肝纤维化分子机制。