基于网络药理学的金复康口服液治疗非小细胞肺癌机制

陈石秀, 陈佳蕾, 谢瑞芳, 周 昕, 许 玲, 董昌盛, 杨 铭*

(1.上海中医药大学附属龙华医院,上海200032；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,上海200437)

由于近年来的空气质量降低及人们生活方式改变,肺癌发病率逐年增加, 以非小细胞肺癌最高［1］。金复康口服液是由上海中医药大学刘嘉湘教授在30 多年临床实践基础上,以中医“养正积自除” 理论为依据所得的经验方［2-3］,主要由黄芪、北沙参、麦冬、女贞子、山茱萸、绞股蓝、淫羊藿、天冬、重楼、石见穿、石上柏、葫芦巴组成,功效益气养阴、清热解毒,用于非小细胞肺癌治疗时临床疗效良好［4］,但其作用机制尚不明确。网络药理学［5-6］是从整体生物水平探讨疾病-机体-药物的关联性,通过组学、高通量筛选、网络可视化、网络分析等技术探讨作用机制、靶点预测、疾病机理等各个方面。本研究将通过该方法从整体上揭示金复康口服液治疗非小细胞肺癌生物分子机制,并为该值二次开发及基础研究提供依据。

1 方法

1.1 化学成分及作用靶点数据库建立 由中国科学院中药化学成分数据库［7］、 TCM Database@Taiwan 数据库［8］、TCM-ID 数据库［9］检索得到,金复康口服液主要化学成分为皂苷类(如黄芪甲苷、异黄芪苷、黄芪皂苷乙、大豆皂苷、人参皂苷类、薯蓣皂苷等)、黄酮类(如淫羊藿苷、淫羊藿次苷等)、有机酸类(如齐墩果酸、熊果酸、女贞子酸等) 等, 而其2D 化学结构信息由PubChem 或Chembl 数据库［10］检索得到,将上述信息综合后建立化学成分数据库。另外,各化学成分作用靶点信息由HIT［10］、 TCMID 数据库检所得到, 并应用NCBI 数据库［11］的Gene 基因搜索功能对其进行标准化,并建立相应数据库。结果,共得到化学成分1 505 种,作用靶标6 424 个。

1.2 疾病及相关基因信息数据库建立 从人类孟德尔遗传数据库［12］(OMIM) 与TTD 数据库［13］中搜索与非小细胞肺癌相关的基因信息,建立疾病及相关基因信息数据库。合并2 个数据库检索结果后,得到29 个相关基因,见表1。

表1 非小细胞肺癌相关基因Tab.1 Relevant genes of non-small cell lung cancer

2 结果

2.1 化学成分及作用靶标筛选

2.1.1 化学成分 对化学成分的类药性评估主要是其AMDE(吸收、分布、代谢、排泄) 性质［14］,将理化特征与已知药物相同特征进行比较时,可有效评估类药性。本研究采用Bickerton 等［15］在2012年提出的类药性评估指标QED,公式为QED ＝, 其中d 为整合8 种主要分子描述符的渴求函数,分别为分子量、油水分配系数、氢键受体数、氢键供体数、分子极性表面积、可旋转键数、芳香环数及非药子结构数。

课题组前期研究显示,QED 可有效评估化合物ADME 性质［16］；本研究通过计算DrugBank 数据库中FDA 批准上市的1 805 种药物QED,并根据其分布选择0.1 作为阈值,对化学成分进行初步筛选,共得到1 099 种满足类药性评估者,剔除没有靶标信息者后,最后得到189 种(MDL)。

2.1.2 作用靶标 本研究采用基于二项分布的富集评分算法［17］来筛选作用靶标,计算靶标分值GS,公式为

表2 金复康口服液主要作用靶标Tab.2 Main action targets for Jinfukang Oral Liquid

2.2 生物靶标多层次网络模型 本研究建立2 种不同程度的扩展网络,即最近邻扩展网络、最短路径扩展网络,主要包括(1) 以HIPPIE［18-19］人类基因交互作用数据为基础,建立以16 503 个基因为节点、 230 434 条边的基因/蛋白交互作用(PPI) 网络； (2) 在PPI 网络基础上,分别提取非小细胞肺癌相关基因及其相应的边,建立相应疾病基因网络； (3) 在PPI 网络基础上,提取作用靶标及其相应的边,建立金复康口服液标网络；(4) 网络扩展［20］,最短路径扩展网为计算所有疾病/复方靶标在网络中两两之间的距离,选取不大于3 的疾病/复方靶标,并将此路径上的相关联基因加入扩展网中,而最邻近扩展网为将所有直接与疾病/复方靶标在网络中相邻接的节点加入扩展网络中,其扩展程度大于前者。

表3 金复康口服液主要活性成分Tab.3 Main active components of Jinfukang Oral Liquid

本研究计算的基本属性如下： (1) 中心度相关属性,有助于发现复杂网络关键节点,用于发现疾病基因或者复方靶标的核心基因或靶标,本研究计算度数中心度 (Degree) 及中间中心度 (Betweenness)；(2) 网络密度与群聚系数,用以衡量复杂网络中靶标间关联紧密度,网络全局群聚系数［21］为3 个靶标基因可容纳的邻接边总值占整个网络的比值； (3) 网络直径与平均最短距离,用以衡量网络中靶标的分散程度。表4 显示,金复康口服液在最短路径扩展网、最邻近扩展网、核心网的节点数较多,平均中心度较高,表明其影响靶标和标靶之间交互作用较多。

表4 金复康口服液与非小细胞肺癌靶标多层次网络比较Tab.4 Comparison of multi-layer networks between Jinfukang Oral Liquid and non-small cell lung cancer targets

表4 金复康口服液与非小细胞肺癌靶标多层次网络比较Tab.4 Comparison of multi-layer networks between Jinfukang Oral Liquid and non-small cell lung cancer targets

指标 金复康口最服短液路 径扩展非网小细胞肺癌 金复康口服最液近 邻扩展非网小细胞肺癌 金复康口服液核 心 网非小细胞肺癌中心度 38.01±37.27 18.11±13.26 41.65±75.38 44.67±66.39 5.86±6.76 1.43±1.91密度 0.042 2 0.100 1 0.006 0 0.016 1 0.045 8 0.052 9中间中心度 609.45±1 389.37 114.27±153.95 5 664.64±71 416.33 1 996.39±15 456.89 68.44±168.52 7.64±16.95节点数 902 182 6 907 2 783 129 28群聚系数 0.176 9 0.280 3 0.085 4 0.131 4 0.284 9 0.103 4直径 5 5 6 6 6 5平均最短距离 2.352 8 2.262 6 2.640 5 2.435 2 2.748 3 2.573 5

表5 金复康口服液与非小细胞肺癌网络节点相似度比较Tab.5 Comparison of network node similarities between Jinfukang Oral Liquid and non-small cell lung cancer

GO 富集分析(图1 ～3) 显示,金复康口服液、非小细胞肺癌靶标在GO 水平上显示出共关联性,在前400 个主要关联的GO 分类中两者共关联占比达49.24%,与两者显著共关联的GO 分类主要有蛋白质结合、凋亡过程、化学物质反应等。

KEGG 富集分析(图4) 显示,在P＜0.01 水平上金复康口服液靶标与35 条信号通路显著关联,而与非小细胞肺癌靶标关联为11 条,与两者均有关联为7 条(表6),主要作用于PI3K-Akt 信号通路、TNF 信号通路、催乳激素信号通路、凋亡信号通路等。

表6 与金复康口服液、非小细胞肺癌靶标显著关联的信号通路Tab.6 Signaling pathways significantly associated with targets for Jinfukang Oral Liquid and non-small cell lung cancer

图1 基于分子功能的GO 富集分析Fig.1 GO enrichment analysis based on molecular functions

图2 基于生物过程的GO 富集分析Fig.2 GO enrichment analysis based on biological processes

大量研究表明［24-26］,PI3K-Akt 信号通路与非小细胞肺癌相关性较高,其活性成分可能是导致细胞异常生长增殖的因素,导致正常细胞在传导中基因畸变；图5 显示,PI3K-Akt 信号通路又与NF-κB信号通路、细胞凋亡信号通路、p53 信号通路等相关联。仅从PI3K-Akt 信号通路靶标来看,金复康口服液作用机制可能是通过调控Akt 蛋白及其下游Casp9、BCL-2、NF-κB、p53 等多个蛋白,共同作用于非小细胞肺癌发展。

图3 基于细胞组件的GO 富集分析Fig.3 GO enrichment analysis based on cellular components

图4 KEGG 富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis

在PI3K-Akt 信号通路中通过配体与RTK 结合而激活,导致PI3K 寡集于细胞膜附近,将PIP2转化为PIP3,后者又可与PKT/Akt 结合,Akt 从细胞质转移至细胞膜,并在PDK1、PDK2 辅助下导致Akt 蛋白Thr308、Ser473 位点磷酸化而激活。活化Akt 下游的多条信号通路转导可促进非小细胞肺癌发展［27］,如磷酸化Akt 抑制GSK3,影响细胞周期进程；抑制Casp9,抑止细胞凋亡；激活IKK、NF-κB 信号通路,促进肿瘤生长发展,并且其下游可能会抑制富集度较高的FoxO 通路,抑制相关蛋白合成,从而抑制肿瘤发生发展［28］,以上可能是金复康口服液治疗非小细胞肺癌的作用机制,表明该制剂可能同时参与体内多种生物过程。

TNF 信号通路与PI3K-Akt 信号通路、NF-κB信号通路、细胞凋亡信号通路等相关［29］,TNF 相关受体及其相关因子TRAFs 家族成员能介导多种下游信号通路的信号传导。在NF-κB 信号通路中,TRAF2、TRAF5、TRAF6 在激活IKK 复合中起到重要作用；促炎症细胞因子TNF-α 也可引起该信号通路激活,从而加速细胞生长,对肿瘤发生发展及转移有着明显的促进作用［30］。

图5 PI3K-Akt 信号通路Fig.5 PI3K-Akt singaling pathways

3 讨论

本研究通过网络药理学对金复康口服液化学成分和作用靶标进行筛选,根据类药性评估结合二项分布,得到85 种满足类药性评估的主要活性成分和130 个复方的主要作用靶标。为了能在更大程度上评估疾病网络与复方靶标网络之间的相关性,本研究又扩展建立了复方生物靶标的多层次复杂网络模型,揭示了金复康口服液与非小细胞肺癌之间内在的关联性；通过主要作用靶标的基因本体及信号通路,进一步揭示了该制剂治疗非小细胞肺癌的部分作用机制。蒋义鑫等［31］报道,金复康口服液通过抑制PI3K-Akt 信号通路激活来抑制A549 细胞增殖,诱导晚期细胞凋亡,其具体机制是通过下调Akt 在T308、S473 位点磷酸化来使Akt 信号通路失活,与本研究结果一致；王志超等［32］发现,金复康口服液能联合化疗减少非小细胞肺癌晚期患者VEGF 分泌,也能抑制PI3K-Akt 信号通路激活；其他研究也表明,金复康口服液可通过降低Bcl-2表达,增加Bax、Fas 表达来诱导LAX-83 人肺腺癌细胞凋亡［33-34］,同时上调p53、p21 蛋白表达,阻止细胞周期,促进细胞凋亡［35］,并且均为PI3KAkt 信号通路的下游通路,为本研究富集靶标。

在采用网路药理学揭示中药复方作用机制的同时,也可通过分析靶标来找到新适应症,阐释组方原理,为相关新药开发提供新思路［36］。但网络药理学在中药研究中仍有许多欠缺,首先中医药相关数据不足,同时数据本身又有着药材质量不可控等许多问题,而不断累积可靠的数据资源是网络药理学研究的基础［37］；其次是还需完善理论算法,在更完善的理论依据下利用各层次实验数据,从而得到更准确的结果。