基于网络药理学的宫外孕Ⅱ号方治疗异位妊娠作用机制

陈 思, 李 净, 刘晓荣, 邓高丕

(1.广州中医药大学第一临床医学院,广东 广州510405；2.广州中医药大学第一附属医院,广东 广州510405)

异位妊娠是指受精卵着床于子宫体腔以外的部位,其主要临床表现为停经、阴道流血、腹痛,甚至晕厥与休克［1］,发病率占妊娠女性的2%,其所致的输卵管破裂出血可致孕妇死亡,是一种十分凶险的妇科急腹症,占妊娠死亡的2.7%［2］。临床上对异位妊娠的治疗可分为药物及手术,甲氨蝶呤为最经典的药物,但有一定的副作用,如胃肠道反应、腹痛加重、肝酶升高、脱发等；手术包括输卵管开窗术及输卵管切除术,前者虽然创伤较小,但术后有8%～9%的患者发生持续异位妊娠,而后者有一定几率影响后续宫内妊娠率［3］,对于有生育要求的育龄期妇女产生不良的影响。

中医认为,异位妊娠发病机理为少腹血瘀［4］,临床上可采用化瘀消癥杀胚类中药治疗,一方面最大程度保全育龄期妇女的生育功能,另一方面治疗早期输卵管妊娠的成功率可达88.9%［5］。宫外孕Ⅱ号方由丹参、赤芍、桃仁、三棱、莪术5 味药材组成,方中丹参、桃仁、赤芍活血化瘀,从而达到消积作用；三棱、莪术行气止痛,消癥散结,诸药合用,共奏活血化瘀、消癥杀胚功效,可改善局部血液微循环,抑制血小板聚集,促进包块消散吸收,减轻病灶周围的粘连［4］,是中医治疗异位妊娠的经典方剂,为活血化瘀、消癥杀胚的代表方,临床疗效明显,对甲氨蝶呤联合米非司酮具有增效减毒作用,患者HCG 水平恢复正常时间及盆腔包块消失时间明显小于单用西药,还能提高患者心理健康、活动评分等生活质量［6-8］；现代药理研究发现,该方可通过抑制滋养细胞的增殖［9］或拮抗雌孕激素来使绒毛组织因缺乏雌孕激素而变性、坏死,达到治疗异位妊娠的作用［10-11］,同时能消炎抗菌,减少炎症反应,消除输卵管粘连,为有效恢复输卵管功能及缩小包块体积提供良好的基础条件,另一方面促进微循环,从而达到消除瘀血、减少不良反应的效果［12］。

中医药特色体现在中药复方对疾病的整体治疗调节,通过多种中药配伍组方来达到治疗疾病的作用。网络药理学作为药物研究的新模式,包括系统生物学、多向药理学、生物信息等多种学科,其整体性、系统性的特点与中医药整体观念、辨证论治、组方配伍的原则不谋而合［13］,可从多靶点的研究策略出发,将药物-靶点网络与生物系统网络相结合,为研究药物机制与靶点提供新策略与方向,并可从大量生物信息资源和中药数据信息中提取相关数据,建立疾病-基因或蛋白质靶标-中药活性成分的相互作用网络,并进行数据挖掘,对中药治疗疾病的机制进行分析预测［14］。因此,本研究将通过网络药理学对宫外孕Ⅱ号方的有效成分进行研究,建立“化合物-靶点-通路” 网络,探究其治疗异位妊娠的作用机制,为后续研究提供参考和依据。

1 方法

1.1 化学成分检索 通过中药系统药理学技术平台(TCMSP) (http： //ibts.hkbu.edu.hk/LSP)检索宫外孕Ⅱ号方中丹参、赤芍、桃仁、三棱、莪术化学成分,共搜集了996 种,其中丹参404 种、赤芍238 种、 桃仁132 种、 三棱60 种、 莪术162 种。

1.2 活性化合物筛选 口服生物利用度是药物吸收、分布、代谢、排泄(ADME) 特性中最重要的药物代谢动力学参数之一,表示口服的药物达到血液循环所占口服剂量的比例,其比例高者一般是决定生物活性分子(即有效作用分子) 类药性的关键指标；类药性是指化合物分子与已知药物分子的相似性,是药物理化性质(相对分子质量、脂水分配系数、溶解度等)、结构特征(如环结构、氢键受体、可旋转键数目和给体数等)、药物分子在体内的综合反映(如血脑屏障渗透性、口服生物利用度等合理的药代动学性质和毒性)。本研究中丹参、赤芍、桃仁、三棱、莪术中的化合物口服生物利用度筛选阈值均≥30%,化合物类药性筛选阈值均≥0.18,得到符合条件的候选化合物。

1.3 靶点和疾病预测 基于TCMSP 数据库,将宫外孕Ⅱ号方的有效化合物逐一配对潜在靶点。同时, 通过蛋白质数据库 (Uniprot Database,http： //www.uniprot.org/) 获得与候选化合物相关的靶点蛋白信息,并在TCMSP 数据库中筛选靶点-靶点对应的疾病。

1.4 化合物-靶点网络构建 将宫外孕Ⅱ号方中化合物及其相关靶点蛋白通过Cytosacape 3.5.1 软件(http： //www.cytoscape.org/) 构建化合物-靶点网络,使两者关系可视化,并对其进行网络拓扑学分析。其中,靶点度值(Degree) 是拓扑结构中的中药参数,可用于评价方中的有效化合物、靶点的重要程度。

1.5 PPI 网络构建 为了阐明靶点蛋白的相互作用,本研究利用string 数据库将靶点蛋白所对应的基因构建PPI 网络,并根据结果统计靶蛋白关联频次,导出可视化同行进行研究分析。 再通过cytocape 软件中的bytohubba 插件,获取度值为前10 的hub 蛋白。

1.6 GO 功能、KEGG 通路富集分析 GO 功能富集分析是指对差异基因的生物途径进行注释及分类并进行富集统计学分析；KEGG 通路富集分析是东京大学和京都大学共同研制的数据库,可查询通路,并与David 数据库相关联。本研究通过David v6.7数据库(http： //david.ncifcrf.gov/) 对PPI网络中的蛋白进行GO 功能、KEGG 通路富集分析,以“P ＜0.05,FDR ＜0.05,基因数大于10”作为条件进行筛选,得出宫外孕Ⅱ号方中化合物的靶点蛋白在基因功能和信号通路中的作用,并利用Cytoscape 3.5.1 软件对GO-BP 富集分析中的GO条目和KEGG 通路富集分析中的通路绘制条形图。

2 结果

2.1 活性化合物 宫外孕Ⅱ号方中有996 个化合物,OB≥30%、DL≥0.18 者有125 个(丹参65个、赤芍29 个、桃仁23 个、三棱5 个、莪术3个),其中丹参与赤芍有共同化合物1 个,赤芍、桃仁与三棱有共同化合物1 个,赤芍与三棱有共同化合物1 个,桃仁、三棱与莪术中有共同化合物1个。见表1。

表1 宫外孕Ⅱ号方中活性化合物Tab.1 Active compounds in No.2 Gongwaiyun Decoction

续表1

2.2 靶点和化合物-靶点网络 宫外孕Ⅱ号方中候选化合物125 个,有119 个可在TCMSP 数据库中匹配,化合物-靶点网络见图1。由图可知,网络中共有230 个节点,其中化合物节点100 个,靶点节点130 个、1 181 条边,每条边表示化合物与靶点直接的关系；度值表示链接该节点的条数,度值越大,表示该节点与其他节点的相互作用越广泛,在网络中起到枢纽的重要作用,度值前6 的化合物为β-谷甾醇 (M358)、1,2,5,6-四氢丹参酮(M1601)、4-亚 甲 丹 参 新 酮(M7049)、 豆 甾 醇(M449)、2-异丙基-8-甲基菲-3,4-二酮(M7041)、鼠尾草酚酮 (M7145),对应的作用靶点分别为46、42、42、40、40、40 个。

β-谷甾醇促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤增生的药理活性明显［15-16］,对肿瘤防治有重要作用,可抗胰腺癌、宫颈癌、肝癌、结肠癌,其机制为可增加细胞内钙离子水平使肿瘤细胞凋亡,或通过上调或下调与癌症发生相关靶基因TP53、 JNK1 表达［17-18］；1,2,5,6-四氢丹参酮、4-亚甲丹参新酮、2-异丙基-8-甲基菲-3,4-二酮、鼠尾草酚酮均属于丹参酮类化合物,具有抗菌、消炎、抗肿瘤作用,还可改善外周血液循环、加快微循环血液流通［19］,此外丹参酮还具有雌激素样活性,可通过影响ERα、ERβ 表达来发挥作用,其机制与降低Bcl-2/bax 比例或诱导p53 表达相关［20-21］； 豆甾醇［22-23］具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症等药理活性,在宫外孕Ⅱ号方治疗异位妊娠的机制中可通过这些机制起到了治疗的作用,也与PPI 网络中的靶点分析及KEGG 富集分析中的信号通路集合相关联。

图1 宫外孕Ⅱ号方化合物-靶点网络Fig.1 Compound-target network for No.2 Gongwaiyun Decoction

另外,度值前5 的靶点蛋白分别为M4 型乙酰胆碱受体(CHRM4)、多巴胺受体D1 (DRD1)、骨骼肌内胰岛素受体 (INSR)、磷酸二酯酶3A(PDE3A)、α1B-肾上腺素受体(ADRA1B),度值分别为80、77、68、67、63。

2.3 PPI 网络及Hub 蛋白提取 将130 个靶点蛋白对应的基因输入String 数据库,获取PPI 网络,网络中含有118 个节点、864 条相互作用关系,见图2,根据节点的高低绘制出前10 对应基因的网络,见图3。

图2 宫外孕Ⅱ号方相关靶点的PPI 网络Fig.2 PPI network for the relevant targets of No.2 Gongwaiyun Decoction

图3 宫外孕Ⅱ号方PPI 网络中靶点基因Fig.3 Target genes in PPI network for No.2 Gongwaiyun Decoction

然后,通过cytohubba 插件中的Degree 算法筛选出前11 的蛋白,作为Hub 蛋白,根据其得分由大至小依次分为肿瘤抑制因子p53(TP53)、转录因子激活蛋白1 (JUN)、 血管内皮生长因子A(VEGFA)、白介素-6(IL6)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤坏死因子(TNF)、雌激素受体1(ESR1)、凝血酵素(F2)、B 淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),分别联系51、50、47、45、43、42、42、40、40、38 个蛋白。其中,TP53 可通过转录调控p21、Bax 等许多靶基因的表达来抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,参与DNA 修复维持基因稳定,抑制肿瘤血管生成［24］；Bcl-2 可通过与该家族的促凋亡蛋白结合而抑制细胞凋亡,也可通过抑制细胞色素C 从而保护细胞不发生凋亡［25］；TNF 靶点可通过介导细胞凋亡的细胞表面分子来诱导细胞凋亡［26］；研究表明,化瘀消癥杀胚复方可从受体水平拮抗雌孕激素,通过促进输卵管蜕膜溶解来加速绒毛组织坏死,从而治疗异位妊娠［11］,而雌激素受体ESR 可与雌激素结合,主要作用为促进女性生殖器官的发育,并对心血管系统、神经系统、胰岛功能、骨代谢、肿瘤等多种系统有重要影响,其功能失调可导致许多雌激素相关疾病［27-31］；MAPK1 为和转录调控因子,与细胞增殖、分化和凋亡有关,雌激素与ESR 结合后,可以来ESR 传导通路调节MAPK1,进而调控相应细胞因子的表达［32］；雌激素作用于ER 后可增强VEGF 表达,同时MAPK1 也是其启动子之一,被激活后也可增强VEGF 表达,从而促进血管发生、形成,增强微血管通透性,改善微循环［30］；有研究发现异位妊娠患者血清中IL-6 水平比宫内早孕妇女或正常非孕妇女高［31］,它为参与机体炎症反应的一种重要的糖蛋白,可直接损伤血管内皮细胞,减少血管内皮前列腺环素的产生,导致血液呈高凝状态并引起血管收缩,同时增加血管细胞黏附分子表达,产生血管收缩因子的平衡紊乱［32］。由此推测,宫外孕Ⅱ号方可通过调控细胞凋亡、拮抗雌孕激素、促进血管发生、改善微循环等方法达到治疗异位妊娠的目的, 而且TP53、TNF、IL-6、MAPK1 等为今后该方药理学研究和临床应用提供的新的思路和依据。

2.4 GO 功能富集分析 在DAVID 平台进行GO功能富集分析,对宫外孕Ⅱ号方PPI 网络中102 个靶点蛋白在基因功能中的作用进行研究,得到314个条目,具有显著意义(P＜0.05) 的有14 个,从中筛选出基因数大于10 个者,共得到8 个,见图4,包括氧化应激,促增殖抑凋亡,对药物、毒物的反应,转录翻译,信号传导。

2.5 KEGG 通路富集分析 在DAVID 平台进行KEGG 通路富集分析功能,对宫外孕Ⅱ号方PPI 网络中102 个蛋白在信号通路中的作用进行研究,得到95 条信号通路,按P＜0.05、FDR＜0.05、基因数大于10 的条件筛选出6 条,见图5,包括神经活性配体-受体相互作用信号通路、癌症信号通路、环腺苷酸的信号通路、血清素神经突触的信号通路、钙离子信号通路、环磷酸鸟苷-蛋白激酶信号通路,通路上基因靶点越多,宫外孕Ⅱ号方越可能通过这些通路来达到治疗作用,具体见表2。

图4 宫外孕Ⅱ号方GO 生物学功能分析Fig.4 GO biological function analysis for No.2 Gongwaiyun Decoction

图5 宫外孕Ⅱ号方KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis for No.2 Gongwaiyun Decoction

大多数基因富集在神经活性配体-受体相互作用通路、癌症信号通路、钙离子信号通路上,分别有30 个(图6)、20 个(图7)、14 个(图8)。其中,癌症信号通路包含许多靶点基因, 如IL6、TP53、MAPK1、JUN、BCL2、VEGFA 等,在PPI网络构建中发现它们可使宫外孕Ⅱ号方起到治疗异位妊娠的作用。

表2 宫外孕Ⅱ号方PPI 网络中的通路（P＜0.01，gene amount=Top 5）Tab.2 Pathways in PPI network for No.2 Gongwaiyun Decoction（P＜0.01，gene amount=Top 5）

3 讨论

异位妊娠属于妇产科常见的急腹症,其发病率呈逐渐增加趋势,考虑到患者生育能力,保证再次妊娠不受到影响,提高保守治疗疗效成为妇产科医生关注的重点之一。中医认为,异位妊娠病机为少腹血瘀证,故大多采用活血化瘀、消癥杀胚法进行治疗, 以宫外孕Ⅱ号方为代表方, 临床疗效良好［8,33-34］。

图6 神经活性配体-受体相互作用通路Fig.6 Neuroactive ligand-receptor interaction pathways

图7 癌症信号通路Fig.7 Cancer signaling pathways

为了进一步探索该方作用机制,本研究采用网络药理学方法,根据化合物、蛋白、信号通路等多个数据库构建网络,并对靶点功能进行富集,系统综合地展现药物对疾病干预和影响的机制。结果,宫外孕Ⅱ号方核心化合物有β-谷甾醇、1,2,5,6-四氢丹参酮、4-亚甲丹参新酮、豆甾醇、2-异丙基-8-甲基菲-3,4-二酮、鼠尾草酚酮等；核心Hub蛋 白 为 TP53、 JUN、 VEGFA、 IL6、 MAPK1、EGFR、TNF、ESR1、F2、BCL2 等；GO 富集分析得出其治疗机制可能为通过氧化应激,促增殖抑凋亡,对药物、毒物的反应,转录翻译及信号传导等；KEGG 通路富集分析表明该方主要作用与Neuroactive ligand-receptor interaction、 pathways in cancer、cAMP signaling pathway、 Serotonergic synapse、 Calcium signaling pathway、 cgmp-PKG signaling pathway 有关。由此预测,宫外孕Ⅱ号方可能通过调节细胞凋亡、抗炎、拮抗雌孕激素,以及改善微血管循环,促进血管生成,从而改善缺血缺氧状态,达到治疗异位妊娠的目的。

图8 钙离子信号通路Fig.8 Calcium ion signaling pathways

综上所述,本研究通过网络药理学对宫外孕Ⅱ号方化合物、靶点、作用通路进行系统分析,初步验证了该方治疗异位妊娠的药理作用及相关机制,为今后进一步研究奠定理论基础。