PMA在副溶血性弧菌检测中的应用

陈光哲　曾德新　周昊　谢青轩　沈嘉敏

摘要：在我国，副溶血性弧菌被认为是海产品衍生疾病的主要因素，因此急需一种能快速、灵敏、特异、准确地检测食品中副溶血性弧菌的方法。传统培养法一直是检测的金标准，但是其检测周期较长;分子生物学方法如聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）已被广泛用于食品中副溶血性弧菌的检测，但是这些方法不能区分死菌和活菌的DNA，容易造成假阳性。而叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，简称PMA）等核酸染料的使用可以有效地消除这一弊端。研究者们将PMA处理与PCR（qPCR）结合，应用于食品中多种食源性致病菌活菌的检测，但是关于PMA在副溶血性弧菌检测中应用的报道并不多见。因此，拟对PMA应用于食品中副溶血性弧菌检测的可行性进行分析，以便为进一步开展相关研究提供参考。

关键词：副溶血性弧菌;活菌检测;食源性病原菌;叠氮溴化丙锭（PMA）

中图分类号： TS207.4  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0162-06

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，简称VP）是导致胃肠道感染的主要致病菌，广泛存在于海水、沉积物和各类海鲜（包括牡蛎、蛤蜊、扇贝、章鱼、虾、蟹、龙虾、克氏原螯虾和众多鱼类）中[1]。VP感染可引起腹泻、呕吐、腹部痉挛，在少数情况下可引起发烧[2]，但并不是所有的副溶血性弧菌都具有致病性。该菌的致病性与耐热直接溶血素（TDH）和耐热相关溶血素（TRH）相关，分别由tdh、trh基因编码[3-5]。此外，VP的主要毒力因子还有不耐热溶血毒素（TLH）。研究表明，TLH是一种非典型的磷脂酶，能溶解人和马的红细胞，具有副溶血性弧菌种属的特异性。TDH能在我妻氏血平板上引起β-溶血（神奈川现象），具有致死毒性、心脏毒性、细胞毒性和肠毒素作用;TRH虽然不能引起神奈川现象，但其与TDH有相似的免疫原性和67%的相同氨基酸序列，并同样具有致死作用和细胞毒性。我国食源性疾病监测网站相关工作人员调查了其监测地区（16个省）14年间的8 000多起食物中毒案例，发现微生物性病原仍然是我国食源性疾病的主要病因（占30%～40%）。近10年来，由交叉污染导致肉类食品或水产品（包括淡水鱼污染）而引起的副溶血性弧菌食物中毒已取代沙门氏菌，跃居第1位[6]。因此，迫切需求一种快速、简便、准确、实用的检测方法对副溶血性弧菌进行实时监控。

用传统培养法检测食品中的副溶血性弧菌一般需要经历增菌、选择性平板培养、生化鉴定等过程，检测周期长达5～7 d。而对副溶血性弧菌的定量检测，在对样品中的病原菌做定量分析后还需要对可疑菌落做定性验证，使得检测周期更长[7-10]。分子生物学方法，如实时荧光定量PCR（qPCR）具有快速、检测灵敏度高的优点，但是这类检测技术无法区分死菌和活菌，因为细菌DNA在菌体死亡后还能留存几天到几周。因此，使用该检测技术用于副溶血性弧菌的定性检测可能导致假阳性，若用于定量检测则无法得到准确的数据[11-12]。  叠氮溴化丙锭（PMA）是一种核酸染料，可用于PCR（qPCR），有效排除死菌DNA的干扰，达到特异性检测活菌的效果[12]。目前，众多学者已将PMA处理同qPCR结合应用于各种活菌检测，包括单增李斯特杆菌[13]、大肠杆菌 O157 ∶ H7[14]、弯曲菌[15]、金黄色葡萄球菌[16]、沙门氏菌[17]等。然而，将上述方法用于副溶血性弧菌检测的研究尚不多见。因此，本研究仅探讨PMA在副溶血性弧菌检测中应用的必要性和可行性，以期为副溶血性弧菌快速检测技术的研究提供新的思路。

1 副溶血性弧菌检测技术概述

1.1 传统培养法

GB 4789.7—2013《食品卫生学检验 副溶血性弧菌检验》中阐述了对副溶血性弧菌检测的传统培养方法。该方法包括增菌培养、选择性平板培养、生化鉴定、血清学反应等过程，整个过程耗时5～7 d。传统培养法可以得到活的病原菌，为检测结果的判定提供了切实有力的证据，一直是食品检测的金标准。但是其耗时长，操作繁琐，给实际检测工作造成了诸多不便;在市场经济高速发展的今天，超长的检测周期也影响了食品贸易的发展;而传统培养法对检测人员的要求也相对较高，可疑菌落的挑选决定了检测结果的准确度，在实际检测中容易出现人为因素而导致的假阳性或假阴性。

1.2 分子生物学检测法

应用于副溶血性弧菌检测的分子生物学检测方法主要包括聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）、变性高效液相色谱检测技术（DHPLC）、基因芯片技术等。PCR技术有操作简单、成本低、用时短等特点，已被广泛用于副溶血性弧菌的检测[6]，但在灵敏度和多基因检测方面有一定的局限性。除普通PCR外，多重PCR（MPCR）和巢式PCR也被广泛应用于副溶血性弧菌的检测中，它们在一定程度上优化了普通PCR，在缩短检测时间的同时可增强PCR的灵敏度和特异性。qPCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，通过检测聚合酶链式反应中产生的荧光信号来实现对VP的定性或定量检测。与PCR相比，qPCR不需要电泳确认，大大提高了检测效率，同时该方法在灵敏度、特异性、重复性等方面也更具有优势。qPCR可分为染料法和探针法，其中探针法通过探针可以增强反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高;染料法经济实惠，可以作溶解曲线，分析全部PCR产物的Tm值，缺点就是特异性相对于探针法较差。LAMP是在PCR的基础上发展起来的，相比于PCR方法，其操作流程更為简单，灵敏度更高，整个检测过程仅需15～30 min，且结果也不需要电泳等途径判定，凭肉眼观察颜色即可[18]。但是其颜色也经常介于阳性和阴性之间，会导致假阳性、假阴性或无法判断[19]。DHPLC常用于分子分型和流行病学研究，但也可用于致病菌的检测。Zhan等利用PCR-DHPLC技术建立副溶血性弧菌特异基因检测平台，可以通过洗脱峰快速判断结果[20]。该方法能有效避免PCR产物电泳检测的后污染，也使检测成本明显降低，具有简便快捷、高通量和自动化的特点，且其准确性和灵敏度高，重复性好，特别适用于大样本量的快速检测。除了上述检测手段外，基因芯片技术也被应用于副溶血性弧菌的检测中。基因芯片可以同时高通量检测多株副溶血性弧菌的多个基因及基因表达、SNP突变和缺失，具有很好的特异性和检测灵敏度，适用于副溶血性弧菌的系统化研究。目前，已有商品化的副溶血性弧菌基因芯片出售。但是基因芯片成本过高，需要特殊的设备，且检测流程复杂，并未得到广泛使用。

1.3 免疫学检测

目前，免疫学检测手段也被广泛应用于副溶血性弧菌的检测，免疫学检测主要是利用抗原-抗体特异性结合的方法鉴别病原菌，具有特异性强、操作简单、耗时短等优点。目前常见的用于副溶血性弧菌检测的免疫学手段有酶联免疫吸附技术（ELISA）、免疫胶体金技术和生物传感器技术。Zhong等基于IgY建立了用于VP检测的夹心ELISA法，该方法的检测灵敏度达到2.5万CFU/mL，耗时仅4 h[21];王报贵等研制了用于VP检测的胶体金试纸条，其检测灵敏度为 106 CFU/mL[22];孔繁德等研发的VP胶体金试纸条的检测灵敏度可以达到3.592万CFU/mL[23]。目前，用于VP检测的商品化ELISA试剂盒及胶体金试纸条已被广泛用于检测机构中，与分子生物学方法相比，它们耗时更短，操作更加简单方便，但是其检测灵敏度却相对偏低。

除了上述常用的方法外，生物传感器技术[24]、上转换发光免疫层析技术也可用于副溶血性弧菌的检测[25]，通过与分子生物学检测技术或免疫学检测技术结合，可进一步优化副溶血性弧菌的检测方法，可以在提高检测灵敏度、增强稳定性等方面发挥积极作用。

然而，值得注意的是，除了传统培养法外，上述检测方法均不能鉴别活菌和死菌。受死菌的干扰，分子生物学检测法和免疫学检测法容易产生假阳性而导致误判，特别是在定量检测中更无法提供真实的检测数据。

2 活菌检测技术

有效检测食品中的VP活菌是评估食品潜在危害并及时做好防控措施的关键和必要条件。除了传统培养法，有2种方法可以快速检测食品中的活菌。第1种是通过反转录（q）PCR检测mRNA的方法[26-27]。有研究表明，由于细菌的转录过程对细胞内外的RNA酶特别敏感，细菌的mRNA含量会在细菌死亡后急剧下降，因此mRNA的检测不同于基于DNA的检测，mRNA仅可在活的且有活力的细胞中被检测到。基于这一理论，反转录定量PCR（RT-PCR）已被应用于多种食源性致病菌的检测，包括肠出血性大肠杆菌、单增李斯特杆菌、沙门氏菌、弧菌属及弯曲菌属等[28-36]。然而，这种检测方法需要表达目的基因，而基因的表达在外界影响下易发生改变。此外，RNA在复杂的食品基质中容易降解。总的来说，使用反转录PCR（qPCR）技术更适合基因表达研究，而不适合用于食源性病原菌检测系统[37]。还有些研究指出，mRNA会在细胞死亡后快速消失[26]，而其他研究者则表示，转录过程在细胞死亡后还会持续较长一段时间[38-39]。第2种检测技术可称为活性PCR（V-PCR）或活性qPCR（V-qPCR），这种方法依赖于对完整细胞膜内DNA的检测。V-（q）PCR技术，分为活性鉴别和（q）PCR扩增2个步骤。目前有2种物质常被用于活性鉴别阶段，即叠氮溴化乙锭（edthidium monoazide，简称EMA）和叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，简称PMA），它们是2种对DNA具有高度亲和力的光敏DNA染料，会被完整的细菌细胞壁排斥，但是能进入受损的细胞壁或细胞膜[40]。进入细胞后，当暴露在强光下时，由于有叠氮基团的存在，上述2种分子染料能与DNA偶联。强光的作用会形成高活性氮自由基，该自由基团能与其附近包括DNA在内的任何有机分子结合生成稳定的共价氮碳键，经过上述核酸染料修饰的DNA将无法进行后续PCR扩增。当EMA/PMA等核酸染料在强光作用下与DNA偶联结合的同时，强光也会促使多余的核酸染料与水分子结合而生成不具有活性的羟胺（hydroxylamine），因此，完整细胞内的DNA在此过程中不会受到核酸染料的影响[41]。经过核酸染料处理后，后续的PCR（qPCR）能特异地扩增细胞膜完整的即活菌内的DNA，实现有效鉴别活菌的目的（图1）。与mRNA检测相比，V-（q）PCR更稳定，可操作性更强，受到众多学者的认可[42-46]。

3 PMA与EMA的比较

PMA、EMA具有几乎相同的排除死菌DNA干扰的功能，但是它们在穿透细胞膜方面有差异。有研究指出，由于化学成分的差异，EMA在信号抑制方面的作用优于PMA，而PMA在鉴别死菌-活菌方面的能力要强于EMA[46]。Nocker等指出，PMA的膜穿透力比EMA差，可能与它们携带的电荷数量有关，他们用4种革兰氏阳性菌和4种革兰氏阴性菌比较EMA和PMA的穿透能力，结果表明，EMA对细胞膜的穿透能力比PMA强，但EMA对活菌DNA具有一定的破坏性[40]。Cawthorn等也指出，EMA对活菌DNA有损害，他们采用与婴幼儿配方奶粉相关的阪崎肠杆菌作为研究对象，结果显示，当用100、50、10 μg/mL PMA处理阪崎杆菌活菌时，总DNA的回收率分别为95%、96%、97%，而用相同浓度的EMA处理时，总DNA的回收率则分别降低为74%、82%、92%，当分别使用上述3种浓度的PMA或EMA作用于死菌（热灭活）时，总DNA的回收率均为0%，从而充分证明了这2种核酸染料在排除死菌干扰方面的能力以及EMA的破坏力[47]。此外，有研究者指出，EMA在选择性扩增活菌DNA方面的能力不如PMA，作为继EMA之后用于活菌检测研究的核酸染料，PMA是一种有效的替代品，更受研究者青睐[48]。

4 PMA在副溶血性弧菌检测中的应用

将PMA处理同（q）PCR结合用于活菌检测的技术已被广泛应用于各种食源性致病菌，包括大肠杆菌O157 ∶ H7[49-51]、沙门氏菌[52-53]、金黄色葡萄球菌[11，45]、單增李斯特杆菌[11，54]、弯曲菌[15，55]等的检测。然而，PMA在副溶血性弧菌活菌检测中的应用并不多见，仅有少数研究者作了相关报道。Zhu等将PMA与qPCR结合，用于检测海鲜食品中副溶血性弧菌活菌，通过与传统培养法和qRCR法比较，表明PMA-qPCR在副溶血性弧菌活菌检测中更具有优势[42]。在该试验设计中，研究者使用了70株不同来源的副溶血性弧菌和120份样品，充分证实了该方法的准确性和可行性;同时研究者也指出，他们构建的检测体系也存在一定的缺陷，对于活菌的有效检出，受到了菌液浓度的约束。

笔者所在实验室也对PMA在副溶血性弧菌活菌检测中的应用作了探索性研究，选择tdh（GenBank登录号：AY249144.1）作为目的基因，设计引物及探针如下：TDH-F：5′-TTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTG-3′;TDH-R：5′-TGACCGGAGCTTGGGTATTA-3′;TDH-P：5′-FAM-TTGGCTGCATTCAAAACATC-TAMRA-3′。將60×106 CFU/mL菌液经10倍梯度稀释至6.0×100 CFU/mL，经Real-Time PCR后，用CT值与菌液浓度构建标准曲线，可获得其检测灵敏度达6 CFU/mL（图2）。为了验证PMA的功效，设计4个试验组，分别为活菌（PMA处理）、死菌（PMA处理）、活菌（未用PMA处理）、死菌（未用PMA处理），其菌液浓度均为6.0×106 CFU/mL，其中死菌经煮沸灭活得到。对于未用PMA处理组，将其菌液提取DNA（TIANGEN，TIANamp Bacteria DNA Kit，DP302）后用于Real-Time PCR扩增[TaKaRa，Premix Ex Taq（probe qPCR），RR390A]，具体步骤严格按操作说明书执行。对于PMA处理组，菌液先经PMA处理，流程如下：在 1 mL 菌液中加入PMA，使其终浓度为50 μmol/L，充分振荡混匀，于暗处静置5 min，将菌液置于距650 W卤素灯20 cm处，强光照射2 min，促使PMA与DNA交联[49]。此后菌液同未处理组一样，经DNA提取纯化后用Real-Time PCR扩增，结果见图3。可以看出，PMA处理能有效鉴别副溶血性弧菌死菌和活菌，当菌液浓度高达6.0×106 CFU/mL 时能充分抑制死菌DNA的PCR扩增，而对活菌无影响。

显然，将PMA与（q）PCR结合，对于实现副溶血性弧菌活菌的快速检测是切实可行的。鉴于食品中有害副溶血性弧菌检测及副溶血性弧菌定量检测的要求，将PMA应用于副溶血性弧菌的快速检测具有很好的应用前景，针对不同食品基质中副溶血性弧菌的检测也有待于学者们的进一步研究。

5 结论

副溶血性弧菌常见于水产品中[56-57]，用传统的培养法对食品中的副溶血性弧菌进行检测一般需要4～5 d，涉及到定量检测则需要7 d，其检测流程复杂，对检测人员要求较高，在可疑菌落挑选方面容易造成人为因素的假阳性或假阴性，此外，5～7 d 的检测周期，会极大影响水产品的品质，增加水产品的贸易成本，造成经济损失。鉴于传统培养法的弊端，迫切需要一种快速、灵敏度高、特异性强的食品中副溶血性弧菌的检测方法。分子生物学方法如PCR、qPCR及LAMP具有检测灵敏度高、特异性强和耗时短等优点，但是上述方法均不能区分活菌和死菌，用于食品中副溶血性弧菌的检测容易导致假阳性的结果。为了解决特异性检测活菌的难题，有研究者使用了反转录PCR检测mRNA的方法，然而由于mRNA提取难度大且易降解，该方法并未广泛使用。此外也有学者研究表明，mRNA并不能代表活细胞，他们指出，RNA的转录在细胞死亡后的一段时间仍会进行。EMA/PMA等核酸染料也被应用到食品中活菌的检测，并得到了众多学者的认可。近期，研究者们对将EMA/PMA与PCR、qPCR或LAMP等技术结合用于食品中活菌的检测做了广泛研究，该方法不仅被应用于活菌的定性检测，也被应用于活菌的定量检测，不仅适用于单一菌种的检测，也适用于多种致病菌的混合检测，不仅被应用于纯培养物的检测，也被应用到各种食品基质的检测。总的来说，这是一种检测食品中活菌切实有效的手段。值得注意的是，众多学者对EMA/PMA在E.coli O157 ∶ H7、沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等食源性致病菌活菌检测中的应用做了研究和报道，而对于副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）仅有少数报道，急需广大学者进一步探索。

PMA-qPCR是目前使用较多的一种方法，具有快速、特异性强、灵敏度高和定量检测等优点;PCR同生物染料结合也有较高的检测灵敏度，虽然不及qPCR，但是该方法可以设计大片段的目的条带，可以避免紫外线（UV）灭活或其他原因造成的假阳性或假阴性结果;EMA/PMA-LAMP法检测灵敏度不及qPCR，但是其操作简单，适用于大量样本的处理。

EMA和PMA同作为具有鉴别功能的核酸染料，对其优越性的比较也受到了广大学者的探讨。多数学者认为，EMA在抑制死菌DNA参与PCR扩增的同时，也能穿透部分活菌的细胞膜并抑制其DNA扩增，从而对实际检测结果造成偏差。PMA比EMA更适合食品基质中活菌的快速检测。随着核酸染料在活菌检测技术中的成熟发展，EMA也逐步被PMA替代。食品中副溶血性弧菌活菌快速检测技术的研究对PMA的选择也无可置疑。当然，也有学者指出，PMA存在缺陷：PMA处理时的强光照射会对菌体造成杀伤;当PCR或qPCR的目的片段过短时，易造成PMA与目的片段结合疏漏，从而导致PMA对死菌DNA的抑制不完全;菌液浓度过高或特殊的成团菌体形态会影响PMA的穿透力，从而影响PMA的处理效果[16，40，42，52，54，58-61]。但是这些缺点并非不能解决，对于强光引起的高温杀伤，可以在PMA处理时用冰浴对菌液降温;对于小目的片段的影响，可以设计特异性强的引物或设计巢式PCR;对于菌液浓度及特殊菌体形态的影响，可以通过稀释及滤膜过滤分解成团菌体。另外，对于浓度过低或复杂基质的情况，可以通过磁珠富集优化。此外，对于部分革兰氏阳性菌细胞膜成分复杂的情况，可以用sodium lauroyl sarcosinate（月桂基巯基乙酸）来增强PMA对死菌细胞膜的通透性。也有学者针对PMA处理工艺进行研究，他们研发的微流体装置能简单、快速地完成PMA标记[62]，为PMA用于食品病原性活菌的快速检测提供了新的动力。总之，PMA在食品中副溶血性弧菌快速检测中的应用是切实可行的，也应受到广泛关注，丰富的水产品种类、不同的水质环境、定性或定量的不同要求以及上述PMA存在的弊端，都有待于广大学者的进一步研究。

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