不同抽薹性萝卜遗传多样性的SSR分子标记分析

杨峰　冉茂林　李晓梅　陈琳　雍小平　冉科

摘要：为了加强对耐抽薹萝卜种质资源的研究，加快耐抽薹萝卜育种进程，从206对SSR分子标记引物中筛选出21对，用于57份不同抽薹性萝卜材料进行遗传多样性分析。结果表明，PCR共扩增出102条条带，平均4.86条，每对引物2～9条带，其中具有多态性的为95条，多态性条带百分率为93.14%。POPGENE分析结果表明，平均观测等位基因数为2.967 4，平均有效等位基因数为2.419 1，有效等位基因比例为81.52%;平均Nei基因多样性指数为 0.355 5，平均Shannon多态性指数为0.528 9。UPGMA法聚类结果把供试萝卜材料分为3个类群，5个亚类：第Ⅰ类为来源于德国的极耐抽薹材料，第Ⅱ类为来源于韩国和日本的耐抽薹材料，第Ⅲ类为来源于我国的材料，其中第3亚类共有45份，占材料总数的78.95%，第4亚类为5份极易抽薹材料，第5亚类仅有1份。各材料间平均遗传相似系数为0.638 1，变幅范围0.347 8～0.934 8，>0.7的仅22.87%，遗传差异较大。不同抽薹性萝卜材料所表现出的丰富多样性，对萝卜种质资源管理和耐抽薹品种选育具有重要意义。

关键词：萝卜;抽薹;SSR标记;遗传多样性

中图分类号： S631.103  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0123-05

萝卜（Raphanus sativus L.）在世界各地均有种植，其中欧美国家主要栽培小型四季萝卜，亚洲国家则主要栽培大型萝卜[1]。萝卜是我国重要的十字花科蔬菜作物，年种植面积在120万hm2左右，位居全国各类蔬菜种植面积第3位，在蔬菜生产和供应上起到了重要作用[2]。在生产上，萝卜比较容易发生“未熟抽薹”或“先期抽薹”現象，即萝卜肉质根在未完全膨大时就抽薹，从而降低或失去商品价值，造成经济损失。我国拥有众多萝卜种质资源，但开始耐抽薹品种选育的研究较晚，导致日本和韩国的耐抽薹品种大量进入国内，占据主要市场。因此，加强对耐抽薹萝卜种质资源的研究，不断培育新的种质资源，是加快耐抽薹萝卜育种进程的重要途径。

简单序列重复（simple sequence repeat，SSR）通常又称为微卫星或者STMS（sequence-tagged microsatellites），是基于PCR的分子标记，普遍分布于真核生物基因组中，具有信息含量高、稳定性好、多态性高、操作和分析简单等优点，现被广泛用于蔬菜种质资源遗传多样性分析[3]及种质资源鉴定[4]等研究。近几年以萝卜为材料利用SSR标记进行的研究，主要包括图谱构建[5-7]、基因组学[8]、转录组学[9]、表观遗传学[10]、纯度鉴定[11-12]、育性鉴定[13]和肉质根色[14]等方面。本研究对57份不同抽薹性萝卜材料进行SSR分析，旨在从分子水平上研究各材料遗传背景和亲缘关系，为选育耐抽薹萝卜品种提供理论依据，以期实现分子标记辅助育种。

1 材料与方法

1.1 材料

供试57份不同抽薹性萝卜材料，均由四川省农业科学院水稻高粱研究所萝卜课题组提供。材料来源及其抽薹特性详见表1。分子标记所需的SSR引物由四川成都擎科梓熙生物技术有限公司合成，Taq酶和dNTP购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 2018年2月26日，在蔬菜种质与品种创新四川省重点实验室进行萝卜穴盘育苗，待幼苗长至3张真叶时采嫩叶，用天根生化科技（北京）有限公司生产的高效植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，微量分光光度计（NanoDrop 2000）检测DNA浓度和质量，将DNA浓度调至10 ng/μL，-20 ℃冰箱（海尔医用低温保存箱）保存备用。

1.2.2 PCR扩增及检测 用Veriti Thermal Cycler PCR仪（Applied Biosystems公司）进行扩增。SSR-PCR反应采用 15 μL 体系，包括1.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+）、1.0 μL 2.5 mmol/L dNTP、0.2 μL 5 U/μL Taq酶、50 ng/μL上、下游引物各0.5 μL、2.0 μL DNA模板，加ddH2O至15 μL。扩增程序：94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性40 s，55～62 ℃（不同SSR引物设不同退火温度）退火45 s，72 ℃延伸90 s，35个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测。

1.2.3 数据统计分析 将银染结果进行统计，清晰且可重复条带记为“1”，不重复且在同一位置上的弱带或无条带记为“0”，建立数据库。统计PCR扩增产物的条带总数和多态性条带数，计算多态性条带百分率P=i/j×100%，其中i为多态性条带数，j为扩增总条带数。用POPGENE 1.32统计观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei基因多样性指数（H）及Shannon多样性信息指数（I）[15]。利用NTSYS pc-2.10e分析数据，按非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析[16]。

2 结果与分析

2.1 SSR引物多样性分析

搜索萝卜基因组数据库（http：//marker.kazusa.or.jp/Daikon/及http：//bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/ radish/）中公布的与抽薹开花相关的SSR引物序列信息，合成了206对，并从中筛选出21对扩增条带清晰、多态性明显较好的引物。分别对57份材料进行PCR扩增，21对SSR引物的扩增结果如表2所示，共扩增出102条条带，每对引物扩增出2～9条条带，平均4.86条，其中具有多态性的95条，多态性条带百分率为93.14%。表明本研究中筛选到的SSR引物多态性良好，有较显著的检出效率，可用于后续的遗传多样性分析。

2.2 遗传多样性分析

通过POPGENE 1.32软件分析，得到表3结果，57份供试材料的平均观测等位基因数为2.967 4，平均有效等位基因数为2.419 1，有效等位基因比例为81.52%。统计分析表明，平均Nei基因多样性指数为0.355 5，平均Shannon多态性指数为0.528 9，均反映出供试材料较高的遗传多样性。

2.3 聚类分析

应用Masatoshi等的统计分析方法[17]，计算遗传相似系数（GS），共获得1 596个两两不同材料间的遗传相似系数（表4），变幅为0.347 8～0.934 8，平均遗传相似系数为 0.638 1，>0.7的仅占22.87%，其中18和19号材料间遗传相似系数最大，为0.934 8，说明二者间亲缘关系最近;2和18、31号间的遗传相似系数最小，为0.347 8，说明它们之间的亲缘关系最远。由此可知，57份材料的遗传背景丰富，可作为育种资源。

根据遗传相似系数采用UPGMA法进行聚类分析，结果如图1所示。以0.57为阈值可以把57份材料分为三大类群：第Ⅰ类包括1、2、3号材料，共3份，均为来源于德国的极耐抽薹材料，占所有极耐抽薹材料的50%;第Ⅱ类为4、5、6号材料，共3份，来源于韩国和日本;第Ⅲ类为其他51份材料，均来源于我国。进一步分析可以把第Ⅲ类分为3个亚类（第3、4、5亚类）：第3亚类共有45份，占所有供试材料的78.95%;第4亚类共有5份，均为极易抽薹材料，占所有极易抽薹材料的83.33%;第5亚类仅有42号材料。

3 讨论与结论

遗传多样性是生物所携带的遗传信息的总和，对分析重要性状和辅助育种具有重要意义。本研究中，SSR引物及遗传多样性结果说明，供试材料间遗传相似程度较低，不同抽薹性萝卜间遗传差异较大，遗传关系较远，这与Wang等利用EST-SSR标记进行遗传多样性分析所得结果中引物多态性89.3%、平均多態信息含量（PIC）值0.39[18]相似。同时聚类分析结果中，本研究分类出的第Ⅲ大类与其研究分类得到的第Ⅰ大类较为相似，但其余分类结果差异较大。方平等对肉质色不同萝卜遗传多样性的分析结果中，平均Na、Ne、I、GS值分别为8.7、5.162 7、1.76、0.85[19]，本研究结果与其差异较大。不同结果的产生，可能与材料来源的丰富程度尤其是野生型材料的多少有关。由于研究目的性状的不同，所选用的分子标记差异较大，对遗传多样性结果的影响较大。

抽薹性状为数量性状，受外界环境影响大，在十字花科蔬菜中的相关研究较多。陈文辉等利用2种分子标记分析耐抽薹大白菜的遗传多样性，其中SRAP标记的平均多态性条带和比率均比ISSR标记高，平均GS值较小而GS变幅较大，来源日本、韩国和我国山东的品种各聚为一类，反映出耐抽薹大白菜间存在一定的地域差异[20]。高颖等利用57个SSR和InDel标记对大白菜抽薹开花时间进行关联分析，将80份自交系及110份F1材料分为3个亚群体，发现13个标记的17个位点与抽薹时间和开花时间相关[21]。在耐抽薹萝卜研究上，柳李旺等将甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）应用于萝卜抽薹机理研究中，证明了DNA甲基化水平的变化影响萝卜抽薹开花，揭示了甲基化水平降低有利于抽薹开花相关基因的表达[22]。刘哲等对萝卜抽薹相关SRAP分子标记进行筛选与分析，获得116对多态性引物组合，多态性40.3%，多态性条带范围为0～5，得到1个与萝卜晚抽薹基因紧密连锁的标记，遗传距离为5.7 cM[23]。本研究中，来源于德国的极耐抽薹萝卜材料分在第Ⅰ大类，日本的极耐抽薹材料时大根在第Ⅱ大类，第Ⅲ大类中则包括了极耐抽薹的藏萝1号和自育的C60223，三类间的亲缘关系较远。其中，日本的时大根与黑萝卜、藏萝1号和C60223间的GS值分别为0.46、0.50、0.43，遗传差异大，可作为耐抽薹杂交亲本材料加以利用。同时，本研究的聚类结果可将大部分地理来源相近的材料聚为一类，但与抽薹性状之间仍存在差别。例如，第4亚类将来源于我国的极易抽薹萝卜材料聚为了一类，但第3亚类中却不能较好地区别开抽薹性不同的材料。这可能是由于SSR标记体现的是种质材料间分子水平上的差异，而表型性状差异是环境与基因互作的结果。

不同抽薹性萝卜材料所表现出的丰富多样性，对萝卜种质资源管理和耐抽薹品种选育具有重要意义。本研究结果能在一定程度上反映出不同抽薹性萝卜材料间的亲缘关系，后续选择遗传相似度低、亲缘关系远的材料作为亲本应用于育种，以提高后代遗传重组率，增强杂种优势。同时，应注意多种分子标记的结合，以期获得更可靠的聚类结果。

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