金属有机框架纳米功能界面的构筑及用于电化学同时检测嘌呤代谢物

王婷婷 张杰 王沈帅 王秀云

摘 要 同时检测DNA代谢产物黄嘌呤（XA）、次黄嘌呤（HX）和尿酸（UA）对代谢异常引起的相关疾病的早期诊断及预防具有十分重要的意义。本研究基于羟基功能化金属有机框架材料（OH-MIL-101（Fe），记为OH-MOFs）及电化学还原氧化石墨烯（ERGO）的协同催化作用，设计并构筑了OH-MOFs-ERGO纳米功能界面，实现了电化学法同时检测血清中尿酸、黄嘌呤和次黄嘌呤。通过超声混合法制备纳米复合功能材料，应用XRD、FT-IR和UV-vis 等方法对材料进行了表征，通过滴涂法及电化学还原法在玻碳电极（GCE）表面构筑了OH-MOFs-ERGO/GCE。此修饰电极检测UA、XA和HX的线性范围分别为 0.20～1150 μmol/L、0.15～800 μmol/L和0.40～600 μmol/L，检出限分别为0.12、0.10和 0.20 μmol/L（S/N=3），实际血清样品中加标回收率在96.1%～106.6% 之间。本方法为嘌呤代谢相关的生理病理研究提供了一种简单快速的检测方法。

关键词 铁基金属有机框架材料; 电化学还原石墨烯; 同时检测; 嘌呤代谢物

1 引 言

黄嘌呤（XA）、次黄嘌呤（HX）和尿酸（UA）作为DNA的代谢产物，在生物体的能量供应、代谢调节等方面具有非常重要的生理作用[1，2] 。在血清和尿液中XA、HX和UA的代谢异常会引发痛风、高尿酸血症、高血压等疾病，与脑梗、糖尿病等疾病也存在相关性[3～5]，因此，建立可同时检测体内黄嘌呤、次黄嘌呤和尿酸的方法对于相关疾病的早期诊断及预防具有重要意义。目前，已报道的嘌呤类物质的检测方法主要有高效液相色谱法[6]、毛细管电泳法[7]和光谱法[8]等。这些分析方法一般需要昂贵的仪器设备，且样品的前处理比较复杂。电化学检测方法由于具有仪器设备简单、易于微型化，尤其是能够实现实时在线检测等优势，是研究涉及嘌呤等物质的生理病理过程的理想方法[5，9，10]。Wang等[4]用精氨酸聚合物与石墨烯混合物修饰电极，实现了人尿液中尿酸、黄嘌呤和次黄嘌呤的检测。孙登明等[10]用循环伏安法制备了银掺杂聚L-赖氨酸修饰玻碳电极，检测人体中黄嘌呤和尿酸的含量，获得了满意的结果。

电极表面结构对电化学分析的性能至关重要。金属有机框架（Metal-organic frameworks， MOFs）材料是通过无机金属离子的空軌道和有机配体的孤电子对形成的配位键连接而成的三维网状结构材料，具有大的比表面积、高孔隙率、化学稳定性强等优势，尤其是根据无机离子和有机配体的不同可以合成晶体取向、形状、尺寸和性质各不相同的MOFs材料，根据分析需求设计其功能结构，在电化学分析领域备受关注[11～14]。而且，MOFs中的活性金属位点和活性结构模块，可直接作为催化剂使用，提高MOFs修饰材料的催化活性，但是该方法易导致骨架坍塌。若将具有催化性能和导电性能的功能材料引入MOFs，将MOFs作为高比表面积的载体，则可同时赋予MOFs复合材料以高稳定性和高催化性能。

石墨烯是由碳原子以sp2杂化而形成的二维碳材料，在导电性、热稳定性、机械性能及电化学性能等方面均展现出独特的优势[15～17]。石墨烯与MOFs纳米复合物可采取简单的物理混合的方法制备，且对环境友好; 两者复合物用于修饰电极，能够促进电极表面与反应底物之间的电子传递，加快反应进程，提高检测灵敏度[18～20]。石墨烯与MOFs的复合材料在电化学分析检测方面已有许多应用，并取得了良好的结果[13]。Wang等[18]通过超声的方法将铜基MOFs（Cu（tpa））与氧化石墨烯（GO）混合，实现了对多巴胺（DA）和对乙酰氨基酚（ACOP）的选择性检测，且灵敏度较高。Ye等[19]将金属有机框架化合物MIL-101（Fe）、石墨粉和石蜡混合物，修饰在电极表面，制成MIL-CPE（MIL-101， Carbon paste electode）电极，对其电化学性能进行了探索，用于检测UA。Guo等[20]将卟啉类金属有机框架化合物与多孔碳材料复合，实现了对UA、XA和HX类物质的检测，相比于常规方法，其灵敏度得到明显提高，线性范围更宽。MOFs与石墨烯构成的复合纳米材料种类多，应用广泛。

MIL-101（Fe）由 Ferey研究组[21]于2005年首次设计合成，具有稳定性强、骨架不易坍塌的优点，其金属离子作为催化活性中心能够促进反应的进行，广泛用于各种催化反应[22，23]。有研究发现，MIL-101（Fe）中的有机框架上的不同官能团的光催化能力不同，羟基修饰的MOF光催化性能最好[22]。本研究设计并合成了羟基官能化的MIL-101（Fe）（记为OH-MOFs）以及与GO构成的纳米复合结构（OH-MOFs-GO），以玻碳电极（GCE）为基底，通过电化学还原法构筑了分析性能良好的纳米功能界面（OH-MOFs-ERGO/GCE），实现了对血清中UA、XA和HX的同时电化学检测。本方法为嘌呤代谢相关的生理病理研究提供了简单易行的检测手段。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CHI660B 电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）; PANanlytical Empyrean-X射线粉末衍射仪（荷兰帕纳科公司）; Bruker Vertex 70-傅里叶变换红外光谱仪（德国布鲁克公司）; Lambda-750紫外-可见分光光度计（美国珀金埃尔默仪器有限公司）。

天然石墨粉（青岛泰华公司）; 尿酸（UA，安耐吉公司）;  XA和HX（北京索莱宝公司）;  DA、FeCl3·6H2O、葡萄糖（Glucose）、NaCl、KCl和MgSO4（美国Sigma公司）; 2-羟基对苯二甲酸、对苯二甲酸、5% Nafion、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）（上海阿拉丁生化科技有限公司）。不同pH值的磷酸盐缓冲溶液（PBS）由0.1 mol/L KH2PO4和0.1 mol/L K2HPO4按不同比例配制而成。所有试剂均为分析纯，无需纯化，直接使用。实验用水为纯净水。

2.2 OH-MOFs-ERGO/GCE 和MOFs-ERGO/GCE的制备方法

按照Hummer法[24]合成GO。MOFs和OH-MOFs的合成参考了文献[20～22]的方法： 取0.675 g FeCl3·6H2O与0.225 g 2-羟基对苯二甲酸（或0.206 g对苯二甲酸）溶解在15 mL DMF中，移入反应釜，于110℃反应24 h，自然冷却后，用DMF洗涤沉淀，在80℃真空干燥，即得到MOFs材料（MIL-101（Fe））和OH-MOFs材料（OH-MIL-101（Fe））。

OH-MOFs-ERGO/GCE和MOFs-ERGO/GCE的制备方法如图1所示。将4 mL 0.1 mg/mL的GO水分散液与1 mL 1 mg/mL  OH-MOFs（或MOFs）水分散液混合，超声2 h，得到OH-MOFs-GO（或MOFs-GO）混合液。取5 μL OH-MOFs-GO（或MOFs-GO）混合液滴涂在玻碳电极（GCE）表面。自然干燥后，在0.1 mol/L PBS溶液（pH 6.0）中，采用循环伏安法（CV）进行电化学还原，电位扫描范围为1.5～0.6 V， 扫速为100 mV/s，扫描10圈至稳定，即分别制得羟基功能化OH-MOFs修饰电极OH-MOFs-ERGO/GCE和MOFs修饰电极MOFs-ERGO/GCE。

电化学检测均采用三电极体系： 以玻碳电极（内径3mm）为工作电极，Ag/AgCl（饱和KCl溶液）为参比电极，螺旋铂丝为对电极。

2.3 实际样品处理与分析

血清取自健康志愿者，无需预处理，直接进行测定。将血清用0.1 mol/L PBS（pH 7.0）稀释至5倍， 然后采用差分脉冲伏安法（DPV）进行检测。

3 结果与讨论

3.1 MOFs材料 与MOFs-GO纳米复合材料的表征

对MOFs材料及MOFs-GO纳米复合材料进行了表征。OH-MOFs（OH-MIL-101（Fe））材料和MOFs（MIL-101（Fe））材料的X-射线粉末衍射（XRD）谱图如图2A所示，MIL-101（Fe） 在2θ=9.8°处出现明显的衍射峰，与已报道的及计算得到的MIL-101（Fe）单晶结构的XRD谱峰位置一致，表明成功合成了MOFs结构。OH-MIL-101（Fe）与MIL-101（Fe）的衍射峰基本重合，说明在MIL-101（Fe）表面引入OH后，MOFs的骨架依然保存，沒有坍塌[25，26]。

图 2B是OH-MIL-101（Fe）和MIL-101（Fe）的红外光谱图，与MIL-101（Fe）的红外光谱相比，OH-MIL-101（Fe）在3409 cm1处有明显的吸收峰，可归属为OH键伸缩振动的吸收峰，表明MOFs复合材料中成功引入了OH。 1602和1396 cm1处的吸收峰可归属为苯环中C=C骨架伸缩振动的吸收峰，进一步证明成功合成了OH-MIL-101（Fe）和MIL-101（Fe）。

利用紫外-可见吸收光谱研究了各材料的电子相互作用。如图2C所示，GO在228 nm处有一个强吸收峰，在299 nm处有一个肩峰，可分别归属为C=C键的 π-π跃迁和CO键的 n-π跃迁产生的吸收峰。当OH-MOFs与GO超声混合后，这两个的吸收峰分别红移至242和308 nm处，且吸收强度减弱，说明复合物中的GO与OH-MIL-101（Fe）之间发生了电子跃迁，也进一步说明OH-MIL-101（Fe）-GO内部存在有利于电子传递的相互作用（可能为氢键或π-π键）[22]。

3.2 UA、XA和HX在不同修饰电极上的电化学响应

利用DPV研究了修饰电极OH-MOFs-ERGO/GCE对3种组分混合溶液的电化学响应性能（图3）。由图3A可见，50 μmol/L的UA、XA和HX单独组分溶液的峰电位分别位于0.3、0.7和1.1 V附近，100 μmol/L的3种组分混合溶液的峰电位相同，但峰电流为其2倍，表明所构建的OH-MOFs-ERGO/GCE能够实现3种组分的分别检测及同时检测。

图3B是UA、XA和HX在不同的修饰电极上的DPV响应，可见3种组分在ERGO/GCE上的响应信号分别是裸电极上响应信号的3.6、 2.9和10.4倍，在MOFs-ERGO/GCE上的响应信号分别是裸电极的2.1、3.2和9.3倍。因此，虽然MOFs的引入增加了材料的比表面积，但与在ERGO/GCE上的响应信号相比，信号未见明显提高。OH-MOFs-ERGO/GCE对3种代谢物的响应信号分别是裸电极响应信号的3.5、7.1和19.8倍，分别是MOFs-ERGO/GCE检测的响应信号的1.7、2.1和2.1倍，即3种组分在OH-MOFs-ERGO/GCE上的响应信号与ERGO/GCE相比得到了进一步提升，说明GO和-OH对响应信号的提高起协同作用。相比于裸电极，ERGO/GCE灵敏性的提高可能是由于ERGO大的比表面积以及其自身良好的导电和催化性能[18，20]，OH-MOFs-ERGO/GCE灵敏度的进一步提高可能是由于OH是强的给电子基团，其氧原子上的孤对电子与苯环上的电子通过p-π 键连接在一起，提高了MOFs的催化性能[22，25]。

3.3 修饰电极OH-MIL-101（Fe）-ERGO/GCE反应动力学研究

利用CV法对UA （1 μmol/L）、XA （2 μmol/L）和HX （1 μmol/L）在OH-MOFs-ERGO/GCE上的电极反应动力学行为进行了研究。如图 4所示，在10～500 mV/s的扫速范围内，峰电流随着扫速增加而增大。3种组分的氧化峰电流均与扫速的平方根成正比，线性方程分别是ipa，UA=87.23v1/2 -2.438（R2=0.9981）、ipa，XA= 21.68v1/2-2.521（R2=0.9881）和ipa，HX= 60.55v1/2-2.438（R2=0.9982），说明3种组分的电极反应均受扩散控制[19，20]，同时也说明OH-MOFs-ERGO 纳米复合结构的电子转移速率快， OH-MOFs与ERGO之间形成了有利于电子传输的通道。

3.4 pH值对UA、XA和HX电化学响应的影响

UA、XA和HX 3种组分都是质子参与的电极反应过程，因此采用CV法研究了溶液pH值对响应峰电流及峰电位的影响（图5）。由图 5A可见，UA （1 μmol/L）、XA （2 μmol/L）和HX （1 μmol/L）3种组分的峰电位都随溶液pH值增大而负移，表明3种组分的电极反应都涉及质子。在酸性至中性条件下，峰电流变化较小; 当溶液呈弱碱性时，3种组分的峰电流均明显降低。

这是因为碱性溶液条件不利于质子参与反应的进行。对于有质子参与的氧化还原反应，根据能斯特方程计算可得知，如果参与反应的质子数与电子数相等，电位对pH线性方程的斜率的理论值为0.059 V/pH。3种组分的峰电位均与溶液pH值呈线性关系，其相应的线性方程是EUA=0.0503pH + 0.7522（R2=0.9999）、EXA=0.0542pH + 1.141（R2=0.9965）和 EHX=0.065pH + 1.523（R2=0.9978），斜率均接近0.059 V/pH。据文献报道，UA、XA和HX的氧化反应都是2质子参与的过程（图6）。上述结果表明，3种组分在OH-MOFs-ERGO/GCE上的电极反应都是2电子和2质子参与的过程[27～29]。

3.5 OH-MOFs-ERGO/GCE同时检测3种组分的线性范围及检出限

利用OH-MOFs-ERGO/GCE对不同浓度UA、XA和HX的混合溶液进行检测，结果如图 7所示。固定两种组分的浓度为 100 μmol/L，改变另一种组分的浓度，记录DPV响应。UA、XA和HX的DPV信号峰分别在0.3、0.7和1.05 V附近。3种组分的DPV信号互不干扰， 可实现3种组分同时检测。3种组分均在各自浓度范围内显示了良好的线性关系，UA的线性范围为0.20～1120 μmol/L，线性方程IUA（μA）=0.0397 + 0.017C （μmol/L）（R2=0.9990）， 检出限为0.12 μmol/L（S/N=3）; XA的线性范围为0.15～800 μmol/L，线性方程IXA（μA）=0.511 + 0.025C（μmol/L）（R2=0.9914）， 检出限为0.10 μmol/L（S/N=3）; HX的线性范围为0.40～600 μmol/L，线性方程为IHX（μA）=2.201 + 0.026C （μmol/L）（R2=0.9955），检出限为0.20 μmol/L（S/N=3）。将本方法与文献报道的检测UA、XA和HX的修饰电极的检测性能比较（表1）可知， OH-MOFs-ERGO/GCE具有较好的灵敏度和更宽的线性范围。

3.6 干扰性、重现性及稳定性研究

电极的抗干扰性、重现性及稳定性是电极应用时的重要性能。对 OH-MOFs-ERGO/GCE 抗干扰性、重现性及稳定性等性能进行了研究。结果表明，血清中生理水平的AA、50倍的DA和葡萄糖及100倍的Na+、Mg2+、K+、Cl、SO24 等离子均不干扰UA、 XA 和 HX （均为0.1 μmol/L）的检测，相对偏差均小于4%。200 μmol/L AA会使2 μmol/L UA的响应电流增加约25%，对HA和XA无影响。3支不同电极对3种组分检测的相对偏差分别为1.9%、3.6% 和 1.3%。电极于空气条件下保存一周后，UA、XA 和 HX的信号衰减分别为1.82%、 3.26% 和3.51%。上述结果说明，所构筑的OH-MOFs-ERGO/GCE具有良好的抗干扰性、重现性和稳定性。

3.7 实际样品分析

将构建的OH-MOFs-ERGO/GCE用于实际血清样品的检测。取1 mL的血清，分别用0.1 mol/L PBS （pH 7.0） 稀释至5 mL，然后用OH-MOFs-ERGO/GCE直接进行检测，检测结果见表2。血清样品的加标回收率在96.1%～106.6% 之间，表明此电极可用于实际血清样品中UA、 XA 和 HX的检测。

4 结 论

本研究基于OH-MOFs的催化性能及ERGO良好的导电性能和催化性能，设计并构筑OH-MOFs-ERGO/GCE，用于嘌呤代谢物UA、XA和HX的检测。3种代谢物在修饰电极上的响应信号分别是裸电极的3.5、7.1和19.8倍，将修饰电极用于血清实际样品中UA、XA和HX的检测，加標回收率在96.1%～106.6%之间。OH-MOFs-GO纳米复合物采用条件温和、环境友好的超声混合方法制备，具有重现性好、易于操作等优点。此修饰电极具有制备方法简单、灵敏度高、线性范围宽、抗干扰性强等优点，有望为嘌呤代谢相关的生理病理研究提供技术支持。

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