夏南牛犊牛口蹄疫母源抗体衰减变化试验研究

石先华， 王之保， 柏中峰， 孙昊堃, 柏中林， 李 静， 孙炳燕

(1.泌阳县动物疫病预防控制中心，河南 泌阳 463700;2.泌阳县夏南牛研究推广中心，河南 泌阳 463700；3.泌阳县动物卫生监督所，河南 泌阳 463700)

1 材料与方法

1.1 材 料

试验牛来自泌阳县新鑫农民专业合作社饲养的夏南牛母牛和犊牛，怀孕母牛25头和其对应出生的犊牛25头，母牛在免疫后15～21 d采集血样。疫苗使用的是国家招标采购的口蹄疫O型、A型双价灭活疫苗，每头母牛注射4 mL，肌肉注射。

采血器材：采样箱、真空采血管、试管架、一次性离心管、5 mL注射器、酒精棉球、干棉球、记号笔、牛鼻钳或绳子、不干胶标签、签字笔、采样单、乳胶手套、一次性鞋帽、口罩、一次性防护服等。

检测试剂与设备：口蹄疫O型抗体检测LB-ELISA试剂盒(新模式,生产批号：E170604，生产日期：2017-06-27)；口蹄疫A型抗体检测LB-ELISA试剂盒(新模式、生产批号：E170703，生产日期：2017-07-27)；试剂盒生产厂家：洛阳莱普生信息科技有限公司。检测仪器：美国伯腾全自动酶标仪，型号ELX-800。

1.2 方 法

1.2.1 牛源准备 对被选母牛在产前1个月左右加强免疫口蹄疫O型、A型双价灭活疫苗1次。母牛产后采血5 mL，检测口蹄疫抗体效价；犊牛出生后的第1天采集血样，以后每间隔1周采集1次血样，根据抗体衰减变化确定下次采血时间。当O型、A型抗体效价<(1∶64)时，视为抗体水平不合格，停止采血。

1.2.2 血样制备 母牛采用尾静脉采血：采血时先将5 mL注射器的针头换用9号针头备用固定牛，使牛尾向上翘。在离尾根10 cm左右中点凹陷处，先用酒精棉球消毒，然后用换好的注射器垂直刺入约1 cm深，针头触及尾骨后退出1 mm进行抽血，每头牛不少于3 mL。采血结束，消毒并用棉球按压止血。

犊牛采用颈静脉采血：将犊牛保定好，使其头部稍前伸，并稍偏向对侧，对颈静脉局部进行剪毛、消毒，看清颈静脉后，采血者用左手拇指或食指与中指，在采血部位稍下方，压迫静脉血管、使之充盈、怒张。如果不剪毛时用手触摸，感觉圆滑、有弹性即是血管，另一手执采血针头，与皮肤成45°角。由下方向上方用力刺入皮肤与血管内，见有血液流出后即可采集血样，每头牛不少于3 mL。采血结束，消毒并用棉球按压止血。当使用真空血管采血失败时，使用5 mL塑料注射器采血。

分离血清：将采集的牛全血倾斜45°角，放置室温静止1 h后，以4 000 r/min离心全血5 min，取上清液，并用记号笔对每份样品进行标记，备用待检。

1.2.3 检测方法 采用国家标准GB/T 18935—2003中的液相阻断ELISA检测方法，对制备的牛血清样品进行O型、A型口蹄疫抗体检测。

1.2.4 判定标准 根据抗体试剂盒说明书的判定标准：病毒抗原对照4孔，去掉最高和最低OD值，计算剩余两孔的平均值OD值，再除以2，即得50%对照值，该值为临界值，表示阻断50%反应的对照OD值。待检样品OD值>临界值，判为阴性；待检样品OD值≤临界值，判为阳性。O型口蹄疫抗体效价≥(1∶128)，判为阳性；抗体效价≤(1∶64)，判为阴性；抗体效价在(1∶64)～(1∶128)时判为可疑。可疑样品需复测，复测抗体效价≥(1∶128)，判为阳性，抗体效价<(1∶128)判为阴性。ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护关系：牛、羊抗体效价≥(1∶128)，99%以上保护；抗体效价在(1∶22)～(1∶90)之间，50%保护；抗体效价≤(1∶16)，不保护。A型口蹄疫试验标准同O型口蹄疫检测标准。

依据《2017年河南省动物疫病监测与流行病学调查计划》(豫牧医[2017]22号)文件，口蹄疫血清学监测、用液相阻断ELISA试验抗体效价≥(1∶64)，判为抗体合格；抗体效价<(1∶64)，判为抗体不合格。存栏家畜的抗体合格率≥70%时判定为群体免疫合格。

2 结果与分析

2.1 检测结果

从表1看出，从检测的25头份母牛血样中，在试验条件下母牛产后O型抗体效价合格率达100%，A型抗体效价合格率达92%。

表1 母牛口蹄疫O型、A型抗体检测结果分析

从表2及犊牛O型、A型口蹄疫母源抗体衰减变化(图1)可以看出，25头犊牛从出生第1天开始对其采血，以后每间隔1周采血1次对抗体进行检测，各检测了156份次。O型口蹄疫第4周抗体合格率达86.96%，第5周、第6周抗体合格率逐步降低至66.67%，31.25%，依据(豫牧医[2017]22号)文件规定的抗体效价评判标准，已是群体免疫不合格。

A型口蹄疫第3周时抗体合格率达75%，第4周降低至39.13%，第5周抗体合格率已为0。依据(豫牧医[2017]22号)文件，第4周时已是群体免疫不合格。

表2 犊牛口蹄疫O型、A型抗体检测结果分析

图1 犊牛O型、A型口蹄疫母源抗体衰减变化

2.2 结 论

试验结果表明：犊牛O型口蹄疫获得母源抗体4周内有较强的保护作用，A型3周内有较强的保护作用。犊牛出生后第1天采血抗体效价与母牛产后抗体效价基本一致，口蹄疫O型抗体效价衰减时间稍长于A型。

2.3 讨 论

本次试验由于样品数量较少，且局限于1个规模养牛场，同时犊牛出生时间也不一致，可能影响检测结果。本次试验数据也可能不具有普遍性。

抗体衰减变化过快，原因有待进一步探讨。从图1可以看出，O型口蹄疫第4周、第5周、第6周抗体合格率分别为86.96%，66.67%，31.25%，每周降幅依次为20.29和35.42个百分点，尤其是第5周至第6周7 d之内抗体效价由6头不合格降至11头不合格。A型口蹄疫第3周时抗体合格率达75%，至第4周时突然降低至39.13%，第5周时降为0，衰减速度过快。分析原因有可能是采样和检测原因，也有可能是犊牛个体差异原因，具体是何种原因还有待进一步探讨。

犊牛何时首免为宜，要因场、因势而定。据刘贺报道：犊牛O型口蹄疫80日龄首免为宜[1]。根据笔者的试验，夏南牛犊牛口蹄疫首免时间在40日龄左右为宜，最长不宜超过60日龄。犊牛何时首免口蹄疫疫苗，各养殖场户要根据具体情况而定：首先要考虑母牛的免疫时间；其次要考虑犊牛的个体差异和体质状况，最关键的是免疫之前一定要对群体犊牛的抗体水平进行检测，小于或等于国家规定的临界值时必须免疫。

关于免疫程序，有待进一步探讨。根据《2017年河南省动物疫病强制免疫计划》的要求，对所有牛、羊、骆驼、鹿进行O型和亚洲I型口蹄疫免疫，对所有奶牛和种公牛进行A型口蹄疫免疫，严格按照说明书，操作规程进行操作。免疫程序：90日龄左右犊牛进行初免，所有新生家畜初免后，间隔1个月后进行1次强化免疫，以后每隔4～6个月免疫1次。

据郭爱珍等《肉牛常用免疫程序》[2]，犊牛3月龄免疫牛口蹄疫疫苗，免疫期6个月。根据笔者的试验数据，结合生产实践，建议夏南牛犊牛口蹄疫首免时间在40 d左右为宜，注射疫苗剂量2 mL/头，在60日龄加强免疫1次，注射疫苗量2 mL/头，以后每隔4～5个月免疫1次。同时建议在夏南牛主产区对肉牛实施口蹄疫O型、A型双价苗免疫。

关于O型与A型口蹄疫疫苗抗体衰减不一致的问题，笔者仅对数据分析，与疫苗质量无关。