脊椎动物神经嵴细胞发育相关非编码RNA研究进展

方熹雅， 刘 洁， 张春兰， 赖振宇， 李世鹏， 吴 菲， 周子惠， 雷初朝， 党瑞华

(西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

1 非编码RNA研究背景

1.1 miRNA

miRNA(microRNAs)，又称为微小RNA，是长度为18～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA，miRNA不参与编码蛋白质，主要调控转录后水平的基因表达。miRNA广泛分布在真核生物体内的不同的细胞系中，相同miRNA家族中的各miRNA在不同的物种中进化的保守性是一致的；同时，不同物种中miRNA对不同生物过程生物的调节也是不同的。microRNA通过使自身5′端非编码区域的一段序列以碱基互补配对的方式与在靶向蛋白基因3′端非翻译区(UTR)之前的靶向蛋白编码基因相结合，从而影响转录出的mRNA的稳定性，即对其进行裂解，或干扰蛋白质的翻译过程。越来越多的研究表明，miRNA控制着许多的生命过程，在调控正常生命活动和疾病方面有着不容忽视的影响，至少超过1/2以上的功能基因都可以被相关的miRNA在转录后水平进行一定的调控，包括各种不同的信号通路[1]。

1.2 其他ncRNA

除了miRNA家族之外,非编码RNA还包括rRNA、tRNA、snRNA、siRNA等。它们功能繁多，积极参与生物体基因表达和关闭，蛋白质合成，细胞增殖等各项生命活动。例如gRNA在mRNA转录中起到指导作用；tmRNA既可以起到与mRNA相似的模板作用，又可起到与tRNA相似的转运作用；snRNA在mRNA前体剪接体中的担任重要的组成成分；snRNA参与rRNA的修饰；siRNA可对特定mRNA的降解进行指导等[2-3]。

1.3 神经嵴细胞研究背景

神经嵴是脊椎动物胚胎发育过程中在神经板弯曲形成神经管时部分边缘细胞形成的胚胎发育中的一种过渡性结构。神经嵴细胞经诱导后可迁移，并可分化成软骨细胞、骨细胞、神经元细胞、黑色素细胞、和平滑肌细胞等[2]。神经嵴细胞的分化是一个由多个信号通路控制的复杂过程，包括Wnt、Fgf和Bmp通路[3]。Bmp信号在决定神经嵴分化方向中起着核心作用[4-5]。在软骨形成过程中，I型受体Bmpr1a和Bmpr1b或受体激活的Smads 1，5和8会导致软骨细胞增殖、分化和存活受到损害，造成严重的软骨发育异常[6]。因此神经嵴细胞的发育对神经系统，肌肉系统以及心脏、颅面等组织有重要作用，所以近年来对于神经嵴细胞的研究越来越多。研究表明，神经嵴细胞发育异常会导致多种疾病。以PAX3和SOX10为中心的基因互作引起的神经嵴细胞功能异常会导致综合征型耳聋[7]。先天性巨结肠(HSCR)也是由于在胚胎时期神经嵴细胞向肠管的定向迁移发生障碍而引起的[8]。此外，家族性神经母细胞瘤，DiCeorge综合征等疾病均与神经嵴细胞发育异常有关。除此之外一些非编码RNA也对其发育有作用[9]。神经嵴细胞的发育对多种组织器官等都有影响，因此相关研究对于神经嵴细胞发育障碍相关疾病的治疗有重要的意义。

2 非编码RNA对神经嵴细胞发育的调控作用

2.2 miRNA对神经嵴细胞发育的调控

目前研究较为广泛和深入的是miRNA在软骨细胞神经嵴谱系分化中的作用。在颅神经嵴细胞的发育中，Oct4，Sox2等叶酸受体α一方面通过与启动子区域结合来上调颅神经嵴细胞中的多能性标志物，另一方面自身调节miR-138和miR-let-7，MiR-138靶向Oct4，miR-let-7靶向Trim71，来调节颅神经嵴细胞的增殖，以使颅神经嵴细胞在分化前保持其多能性表型和增殖潜能[10]。而miR-873被Koufaris等人使用生物信息分析方法证明参与Hedgehog信号传导的调控，Hedgehog信号通路是颅面形态形成和分化的重要途径。其可能靶标为ZIC2，然而仍需要在动物模型中进行进一步研究来确认miR-873的调节作用[11]。

在斑马鱼模型上的实验发现，斑马鱼中存在2个mir92a，mir92a-1和mir92a-2虽然序列相同，但分别由mir17-92簇和mir106a-92簇编码。miR-92a的失活增加了咽部区域的Nog3水平，咽部软骨形成祖细胞的细胞增殖，分化和存活显著减少，导致咽部软骨的损失[12]。Ning等通过双荧光原位杂交以及向斑马鱼胚胎中注入92a-MO的方法研究发现，mir92a可以通过靶向noggin3解除BMP信号并诱导软骨细胞凋亡影响颅面部发育[12]。Wang等应用了3'UTR荧光素酶报告基因以及位点突变的方法，对mir17-92对于唇腭裂的影响进行研究。结果表明，小鼠体内miR-17-92簇的缺失会导致颅面畸形[13]。此外，研究表明mir-17-92簇直接抑制了在颅面发育过程中具有重要的功能的T-box因子。并且进一步证明，miR-17-92是由BMP信号和转录因子AP-2α直接激活的。miR-27则靶向粘着对软骨的形成有负调节作用的整合素介导的细胞外基质粘附的关键调节因子斑激酶Ptk2aa[14]。Kara等人对miR-27的敲除实验证明miR-27可下调咽弓中的Ptk2aa，促进软骨细胞分化。miR-27的缺失可导致软骨原细胞的增殖和分化受损。王冬玥等人则使用斑马鱼模型在显微镜下注射mir-1反义核苷酸(MO)抑制mir-1，观察下颌骨的生长情况并利用整体TUNEL染色技术和pH3免疫荧光技术发现mir-1对于神经嵴细胞的发育具有正向调控作用[9]。魏安瑶等人通过在斑马鱼胚胎中注射与其miRNA-23a序列完全互补的MO以抑制斑马鱼胚胎内源性miRNA-23a的活性，并通过阿尔新蓝染色法以及原位杂交法观察低表达的miRNA-23a对斑马鱼颅面部软骨发育的影响时发现低表达的miRNA-23a会导致斑马鱼胚胎的咽区软骨缺失，为了进一步确认miRNA-23a在神经嵴细胞向斑马鱼咽部迁移过程中的作用，采用激光共聚焦显微镜拍摄并对结果进行分析发现miRNA-23a抑制神经嵴细胞从后脑向咽部迁移并导致其不能分化成为软骨细胞，从而导致了斑马鱼胚胎的咽区软骨缺失[15]。

在对神经嵴衍生细胞谱系的研究中，王艳华等人采用流动分选法分离人毛囊神经嵴干细胞定向诱导，在诱导过程中分为对照组，加入mir-21激动剂组，加入mir-21抑制剂组，无活性的microRNA类似物组，qRT-PCR检测mir-21表达水平。结果表明，mir-21的表达水平在毛囊神经嵴干细胞分化过程中逐渐升高。转染对mir-21有激活作用的agomir-21后，干细胞分化为schwann细胞的能力增强，转染mir-21抑制剂antagomir-21后干细胞分化的能力减弱。证明mir-21可以促进神经嵴干细胞向schwann细胞分化[16]。

神经嵴衍生的交感肾上腺细胞谱系产生交感神经元和肾上腺髓质的内分泌嗜铬细胞，两种细胞表达了大量重叠的基因。miR-124在发育的交感神经元中是可检测的，但在嗜铬细胞前体中不存在。Stella等人证明了miR-124在转染到培养的嗜铬细胞中时促进神经突伸长，表明miR-124可以促进在非神经元交感肾上腺细胞中建立神经元形态[17]。进一步研究发现用神经营养素神经生长因子治疗PC12细胞会导致miR-124表达上调，而抑制miR-124会降低PC12细胞中神经生长因子诱导的神经突的生长。表明miR-124有助于在发育中的交感肾上腺细胞中建立特定的神经元特征[17]。

在对神经嵴细胞凋亡过程的研究中，Chen等人将神经嵴细胞暴露在不同浓度的乙醇中，发现体外和体内乙醇处理均可显着降低胚胎细胞或组织中miR-125b的表达，暴露于50 mM乙醇导致Bak1蛋白和PUMA蛋白表达显着增加，表明miR-125b的直接靶点Bak1和PUMA参与了乙醇诱导的神经嵴细胞凋亡[18]。同时用乙醇处理miR-125b模拟物转染的神经嵴细胞，发现miR-125b模拟物过表达miR-125b可抑制乙醇诱导的Bak1蛋白表达增加。miR-125b水平的上调也降低了暴露于乙醇的神经嵴细胞中PUMA蛋白的表达。此外，用miR-125b模拟物处理大大降低了神经嵴细胞中乙醇诱导的caspase-3活化。表明miR-125b参与乙醇诱导的细胞凋亡，并且miR-125b的过表达可以阻止乙醇诱导的神经嵴细胞细胞凋亡[18]。

神经嵴细胞在原肠胚形成期间在外胚层中被诱导，在神经系统发育过程中外胚层形成的神经板分化成神经管以及神经嵴[19]，发育后期，神经管构成整个中枢神经系统，神经嵴细胞则可以继续分化形成外周神经系统的细胞[20]。Xi等利用胚胎干细胞神经分化系统的研究表明在神经系统发育初始阶段Pou3f1-miR-29b-Dnmt3a轴非常活跃，即mir-29b可以通过DNA甲基转移酶3a(Dnmt3a)以及转录因子Pou3f1调节胚胎干细胞分化成神经管并抑制其向神经嵴细胞方向的分化[21]。Nicole等人使用源自非洲爪蟾胚胎的外胚层移植体的文库进行测序，同时对外胚层和囊胚阶段组织进行测序，发现miR-301a，miR-338和miR-427以及5种miR-427在不同组织中差异表达的亚型或异构体在所有4种组织类型中高度表达[22]。表明这些miRNA对于维持神经嵴细胞的干细胞样表型具有一定作用(表1)。

表1 近5年已证明与神经嵴细胞发育有关的miRNA及其靶点

2.3 其他ncRNA对神经嵴细胞增殖分化的调控

近几年来，更为广泛的研究显示除miRNA外lncRNA Pnky，BDNF-As等非编码RNA对神经嵴细胞的增殖分化也具有一定的调控作用。Liu等人采用RT-PCR技术分析了HA117在不同结肠段的表达情况，利用荧光原位杂交技术(FISH)检测HA117在肠壁的分布，发现一种长链非编码RNA(LncRNA)的视网膜相关转录本HA117参与了HSCR的发生，并在其中起到了抗分化作用[24]。Ramos等发现了神经特异性长链非编码RNA-Pnky。Pnky主要与剪切调节因子PTBT1相互作用，相关敲低实验表明，Pnky可以促进神经嵴细胞的分化，降低增殖[25]。另外，Modarresi等研究发现，脑源性神经营养因子基因(BDNF)的非编码反义RNA转录物(BDNF-As)可以通过改变BDNF位点上的染色质结构来抑制RNA转录，从而降低内源性BDNF蛋白的水平，对神经嵴细胞的生长、成熟以及分化等起到了一定的作用[26]。Walter等人发现人环状RNA与小脑退化相关蛋白1转录本(CDR1as)反义，CDR1as在神经元组织中极易与miR-7结合，吸附并抑制miRNA-7的正常功能，从而影响神经嵴细胞发育[27]。

3 小结与展望

本文介绍了与神经嵴细胞发育、分化、凋亡有关的非编码RNA近年来的研究进展，并以miRNA以及其他非编码RNA在神经嵴细胞诱导，软骨细胞神经嵴谱系分化，神经嵴衍生细胞谱系分化，神经嵴细胞凋亡等几个过程中的作用为落脚点，收集整理了近5年经试验证实与神经嵴细胞发育具有相关性的miRNA和其他非编码RNA及其靶基因，但是仍有部分miRNA还未发现或证实其靶点。此外还有许多已被证实对体内其他细胞组织发育具有调节作用的miRNA,其对神经嵴细胞发育的作用仍然有待探索和研究。神经嵴细胞的发育是一个受多种信号通路调控的复杂过程，发育异常则会导致综合征型耳聋，神经母细胞瘤，DiCeorge综合征等疾病。因此相关研究对于神经系统，肌肉系统以及心脏、颅面等组织的发育异常疾病的治疗具有重要意义。