T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1在膀胱癌组织中的表达及其与膀胱癌复发的关系

苏宏伟 刘军超 李 婷 曹 娟 李 晨 刘 鑫 李向东

(河北北方学院附属第一医院1 泌尿外科，2 病理科，张家口市 075000,电子邮箱：suhwwww@sina.com；3 河北省张家口市第二医院药械科，张家口市 075000)

膀胱癌是泌尿系统中常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤前列[1]。资料显示，2016年全球膀胱癌的发病人数约43万，死亡人数约16.5万，其发病率和死亡率均呈上升趋势，严重威胁人类的生命安全[2]。尽管手术联合放化疗可以提高膀胱癌患者的总体生存率，但仍有部分患者出现复发和转移，导致其5年生存率仍较低[3]。膀胱癌的侵袭和转移是影响膀胱癌患者治疗和预后的重要因素，因此，探讨膀胱癌侵袭和转移的分子机制具有重要意义。大量研究显示[4-8]，T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T-lymphoma invasion and metastasis-inducing factor 1，Tiam1)在多种肿瘤中呈高表达，与肿瘤细胞的侵袭、转移、恶性程度及预后密切相关。然而，目前关于Tiam1在膀胱癌组织中表达的研究较少。本研究探讨Tiam1在膀胱癌组织中的表达及其与膀胱癌患者预后的关系，为膀胱癌的早期诊断、临床治疗及预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 标本来源 选择2009年1月至2013年4月在我院泌尿外科住院手术治疗的233例膀胱尿路上皮癌患者，收集其膀胱癌组织，其中男125例、女108例；年龄(57.4±6.7)岁；术后病理结果提示低级别尿路上皮癌127例，高级别尿路上皮癌106例；行膀胱部分切除术18例，膀胱根治性切除77例。纳入标准：(1)均经病理确诊为膀胱尿路上皮癌；(2)均具有完整的临床资料、病理资料及随访资料；(3)术前均未接受放疗、化疗(包括膀胱灌注)等治疗。排除标准：(1)合并其他器官恶性肿瘤；(2)曾行化疗、放疗，包括新辅助化疗；(3)合并膀胱结石。膀胱癌组织标本分为两部分，一部分行常规蜡块包埋，一部分于液氮中冻存。另取同期50例行耻骨上前列腺切除术的男性患者的正常膀胱组织为对照组，年龄(61.5±4.7)岁，正常膀胱组织存于液氮中冷冻备用。所有患者均常规膀胱镜随访5～7年，2年内每3个月复查1次，2年后每半年复查1次，5年后每年复查1次，记录复发情况。本研究获河北北方学院附属第一医院伦理委员会审查通过，所有患者均知情同意。

1.2 主要试剂和仪器 兔抗人Tiam1单克隆抗体(批号：sc-377355)、β-肌动蛋白抗体(批号：sc-9996)、生物素标记的二抗(鼠抗兔多克隆抗体，批号：sc-2004)均购于美国Santa Cruz公司。免疫组化试剂盒(批号：PV-9000)购于北京中杉金桥公司。引物设计由上海生工生物工程有限公司提供。PCR试剂盒(批号：4472908)、总RNA提取试剂盒(批号：15596-018)、逆转录试剂盒(批号：k1622)购于美国Invitrogen公司。Bio-Rad iMark型酶标仪、Bio-Rad ChemiDoc MP型凝胶成像分析仪均购于美国Bio-Rad公司，CKX53型倒置显微镜购于日本Olympus公司。

1.3 免疫组化检测Tima1蛋白阳性率 将膀胱癌及正常膀胱组织标本用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋后，用切片机切成厚度为4 μm的切片，经二甲苯和酒精脱蜡水化后，加入pH=7.4、浓度为0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液高压修复，并以3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶。以非免疫血清封闭后，加入Tima1抗体(1 ∶150稀释)孵育，4℃过夜，再加入生物素标记二抗，孵育20 min。加入链霉菌素抗生素(辣根酶标记)溶液反应10 min，经二氨基联苯胺显色、苏木精复染和常规脱水封片后，磷酸缓冲盐溶液代替一抗作为阴性对照。显微镜下随机选取5个视野。观察每个组织的细胞着色情况，每张切片均由两名高年资病理科医生进行观察。Tima1蛋白主要定位于细胞膜和细胞质中，棕褐色颗粒为强阳性，棕黄色为阳性，淡棕色颗粒为弱阳性，无显色为阴性。细胞出现强阳性、阳性、弱阳性染色均判断为表达阳性，表达阳性率=阳性切片数/总例数×100%。

1.4 实时定量PCR检测Tiam1 mRNA表达 采用总RNA提取试剂盒提取两组标本的总RNA，用逆转录试剂盒反转录合成cDNA，取10 μL cDNA加入PCR反应试剂盒中，以25 μL总反应体系进行实时定量PCR扩增，按照35个循环(95℃ 30 s、56℃ 15 s、72℃ 30 s)的反应条件进行扩增。实验重复3次。取5 μL PCR扩增产物，上浓度为1%的琼脂糖凝胶进行电泳，以β-肌动蛋白作内参对照，2-△△CT法计算Tiam1 mRNA的相对表达情况。β-肌动蛋白上游引物序列5′-CTGTGCCCATCTACGAGGGGTATG-3′，下游引物序列5′-CCTTAATGTCACGCACGATTTCCC-3′；Tiam1上游引物序列5′-GCCAAGAACAT-TTAACAAGCAACG-3′；下游引物序列5′-TCTGAGCATACAAGTCACCCAAGG-3′。

1.5 蛋白免疫印迹检测Tiam1 蛋白表达 参照总蛋白提取试剂盒说明书提取两组标本总蛋白，加入等量的上样缓冲液，置于沸水浴中变性3～5 min，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以美国伯乐Mini-Protean Ⅱ蛋白电泳槽将目的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上后，浸入1×TBST(含5%脱脂奶粉)中平衡2 h。加入一抗Tiam1和β-肌动蛋白抗体(1 ∶800稀释，4℃，孵育过夜)和辣根过氧化酶标记的二抗(1 ∶2 000稀释，37 ℃，孵育2 h)，以化学发光剂ECL显色，凝胶成像系统扫描检测。结果用Tiam1灰度值比β-肌动蛋白灰度值的相对值表示。

1.6 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料采用例数或百分数表示，比较采用χ2检验，多组间比较采用单因素方差分析，影响因素分析采用Cox回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 膀胱癌与正常膀胱组织Tiam1蛋白阳性表达率比较 Tiam1在正常膀胱黏膜上皮细胞及膀胱癌细胞中均表达，主要分布在细胞膜和细胞质中，染色呈黄色至棕褐色不等(图1)。正常膀胱黏膜上皮细胞Tiam1表达阳性率为14.00%(7/50)，低于膀胱癌细胞的58.79%(137/233)(χ2=11.037，P<0.001)。

正常膀胱 低级别非肌层浸润性膀胱癌 高级别非肌层浸润性膀胱癌 高级别肌层浸润性膀胱癌

图1 Tiam1在膀胱癌中的表达(×400)

2.2 膀胱癌Tiam1蛋白阳性表达组与Tiam1蛋白阴性表达组的临床病理特征 膀胱癌Tiam1阳性表达组和Tiam1阴性表达组的病理分级、病理分期、淋巴结转移情况及复发率比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 Tiam1蛋白阳性表达组和Tiam1蛋白阴性表达组膀胱癌患者的临床病理特征

注：*行根治性手术77例患者不予统计复发情况。

2.3 Cox多因素回归分析 以是否复发(否=0，是=1)为因变量，性别(男=0，女性=1)、年龄(≤50岁=0，>50岁=1)、病理分级(低级别=0，高级别=1)、病理分期(Ta～T1=0，T2～T3=1)、肿瘤数目(单发=0，多发=1)、肿瘤直径(≤2 cm=0，>2 cm=1)、淋巴结转移情况(否=0，是=1)、Tiam1蛋白表达情况(阴性=0，阳性=1)为协变量进行Cox回归分析，结果显示，病理高分级、病理分期为T2～T3、淋巴结转移阳性及Tiam1蛋白表达阳性是膀胱癌患者复发的危险因素(均P<0.05)，见表2。

表2 膀胱癌复发的多因素分析

2.4 膀胱癌与正常膀胱组织Tiam1 mRNA相对表达量比较 正常膀胱细胞和膀胱癌细胞中Tiam1 mRNA的相对表达量分别为(1.603±0.571)、(3.324±0.679)，两者比较差异有统计学意义(t=8.602，P<0.001)。低级别非肌层浸润性膀胱癌、高级别非肌层浸润性膀胱癌、高级别肌层浸润性膀胱癌Tiam1 mRNA的相对表达量分别为(3.007±0.611)、(3.933±1.003)、(5.377±1.085)，三者比较差异有统计学意义(F=13.033，P<0.001)，见图2。

图2 正常膀胱组织与膀胱癌组织中的Tiam1 mRNA表达

注：M为Marker，N为正常膀胱组织，1为低级别非肌层浸润性膀胱癌，2为高级别非肌层浸润性膀胱癌，3为高级别肌层浸润性膀胱癌。

2.5 膀胱癌与正常膀胱组织Tiam1蛋白的相对表达量比较 正常膀胱组织与膀胱癌组织中Tiam1 蛋白的相对表达量分别为(1.654±0.610)、(3.473±0.751)，两者比较差异有统计学意义(t=10.011，P<0.05)。低级别尿路上皮癌、高级别非肌层浸润性膀胱癌及高级别肌层浸润性膀胱癌中Tiam1 蛋白的相对表达量分别为(2.985±0.455)、(3.002±1.033)、(5.150±1.441)，三者比较差异有统计学意义(F=15.370，P<0.001)，见图3。

图3 Tiam1蛋白在正常膀胱组织及膀胱尿路上皮癌中的表达

注：N为正常膀胱，1为低级别尿路上皮癌，2为高级别非肌层浸润性尿路上皮癌，3为高级别肌层浸润性尿路上皮癌。

3 讨 论

90%以上的原发性膀胱癌经手术治疗后均取得较好效果，但膀胱癌术后5年复发率为60%左右，且30%左右的患者会进展为浸润性膀胱癌，而目前对于浸润性和复发性膀胱癌的治疗效果有限，预后较差[9-10]。肿瘤转移与患者预后密切相关，而目前膀胱癌侵袭转移的潜在分子机制尚未完全阐明，因此，本研究探讨Tiam1在膀胱癌组织中的表达情况，拟为膀胱癌的治疗提供新靶点。

Tiam1属于鸟苷酸交换因子家族成员之一，是一种具有高度亲水性的胞液蛋白质，其功能区域从N端至C端依次为Myr位点、PEST序列、PHn-CC-Ex、RBD、DHR、DH以及PHc结构域[11]。Tiam1可通过与脂类或蛋白质分子结合进行亚细胞定位及活性调节，可催化Rho类蛋白的二磷酸鸟苷-三磷酸鸟苷交换反应，参与调节Rho类蛋白活性，传导不同细胞内信号激活Rho三磷酸鸟苷酶，从而在多种生物分化过程中起作用[12]。Tiam1可特异性激活Ras相关的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)，通过Tiam1-Rac1信号通路调控肿瘤细胞的侵袭和转移[13-14]。研究表明，Tiam1通过激活骨桥蛋白-CD44-Tiam1-Rac1通路抑制肿瘤抑制基因Rho二磷酸鸟苷离解抑制因子2，从而促进膀胱癌细胞的转移及扩散[15]。

本研究采用免疫组化方法检测Tiam1蛋白在膀胱癌组织中的表达情况，结果显示，正常膀胱及膀胱癌组织中均有Tiam1蛋白的阳性表达，但膀胱癌组织中的Tiam1蛋白表达阳性率高于正常膀胱组织(P<0.05)，且低分期、低分级、未发生淋巴结转移及未复发的膀胱癌患者的膀胱癌组织中Tiam1蛋白表达阳性率低于高分期、高级别、淋巴结转移阳性及复发的膀胱癌患者(均P<0.05)，蛋白免疫印迹及实时定量PCR结果也证实，Tiam1蛋白在膀胱癌中的表达高于正常膀胱组织，说明Tiam1作为促癌基因，在膀胱癌的发生、发展中发挥重要作用。本研究多因素Cox回归分析结果显示，肿瘤病理高分级、高分期、淋巴结转移阳性及Tiam1蛋白表达阳性是膀胱癌患者复发的危险因素(均P<0.05)，提示Tiam1蛋白可以作为膀胱癌复发的预测因子，应对Tiam1阳性表达的膀胱癌患者进行密切的观察随访，以早期诊断及治疗。

综上所述，Tiam1在膀胱癌中表达升高，且Tiam1蛋白表达阳性与膀胱癌复发密切相关，是膀胱癌进展、复发的重要细胞因子，但其促进膀胱癌发生、发展的具体机制尚有待进一步研究。