溴酸钾-荧光黄-双酚A体系的共振光散射研究及其应用

杨洋，李贵荣，徐梦媛，唐律

(南华大学 公共卫生学院，湖南 衡阳 421001)

双酚A(BPA)是一种环境内分泌干扰物[1]，可以通过水污染危害人体健康[2-3]。生殖表观遗传效应[4]、慢性肾病[5]、糖尿病[6]、癌症[7]等都与BPA 的污染有关。

检测BPA 的方法主要有：气相色谱-质谱法[8]、高效液相色谱法[9]、毛细管电泳法[10]、传感器检测法[11]和分光光度法[12]等。其中某些方法存在仪器成本高、操作复杂、准确度相对不高等不足 。共振光散射光技术具有操作简便、线性范围宽等特点[13]。

在硫酸介质中，BPA 能够和溴酸钾、荧光黄反应形成聚集体，体系共振光散射强度的增大值(ΔI)与 BPA 含量在一定范围内成正比，据此定量检测水样中的 BPA。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

BPA、硫酸均为优级纯；无水乙醇、荧光黄、溴酸钾均为分析纯；实验用水均为二次蒸馏水。

RF-4500型荧光分光光度计；UV-VIS 8500 紫外-可见分光光度计；SHHW-21三用电热恒温水浴箱；AB204-S电子分析天平。

1.2 BPA标准溶液(5.0 μg/mL)配制

准确称取0.050 0 g BPA 溶于无水乙醇中，加入超纯水，稀释至100 mL，超声溶解，得到浓度为0.5 mg/mL的储备液。使用时用超纯水将此溶液稀释至5.0 μg/mL。

1.3 实验方法

在10 mL比色管中，分别加入一定量的双酚 A 标准溶液或水样，0.60 mL硫酸溶液(0.10 mol/L)，0.50 mL荧光黄溶液(1.0 ×10-4mol/L)，0.40 mL溴酸钾溶液(0.10 mol/L)，超纯水稀释定容至5.00 mL刻度线，充分摇匀，于70 ℃水浴加热反应15 min，用流动自来水冷却，以终止反应。在荧光分光光度计上以λex=λem电压700 V，激发和发射狭缝均为5 nm时，进行同步扫描，得共振光散射光谱。准确测定489 nm波长处共振光散射强度(I)值及试剂空白共振光散射值(I0)，并计算ΔI(ΔI=I-I0)。

2 结果与讨论

2.1 共振光散射光谱图

不同体系的共振光散射光谱见图1。

图1 不同反应体系的共振光散射光谱图Fig.1 The resonance light scattering spectra of different reaction systems1.H2SO4+FL；2.H2SO4+FL+BPA；3.H2SO4+FL+KBrO3；4～6.H2SO4+FL+KBrO3+BPA (0.8，2.0，3.0 μg/mL)

由图1可知，在H2SO4介质中，荧光黄溶液的共振光散射值较小(曲线1)，最大共振光散射波长为489 nm。往体系中加入BPA时，共振光散射值未发生明显变化(曲线 2)，说明低浓度BPA并不引起体系的共振光散射强度变化；若单独加入溴酸钾时，共振光散射强度增强(曲线3)。当同时加入溴酸钾和痕量 BPA 时，体系共振光散射强度会显著增强，且随BPA加入量增多而增强(曲线 4～6)，共振光散射强度增大值(ΔI)与BPA浓度在一定范围内呈线性关系，从而可用于定量检测BPA。

在H2SO4介质中，溴酸钾能氧化荧光黄[C20H12O5]，氧化产物能发生质子化而形成带正电荷的阳离子[C20H12O5]+，后者能与过量的带负电荷的溴酸根离子形成粒径增大的离子缔合物，导致体系的共振光散射强度增强。其反应可表示为：

但当加入BPA时，因溴酸钾过量，溴酸钾同时氧化BPA，形成醌式产物，并质子化[C15H17O2]+[14]，与溴酸根阴离子生成离子缔合物。

两种离子缔合物之间通过范德华力、疏水作用力等聚集成更大的聚集体，体系共振光散射强度明显增强。共聚集体的结构可能为：

2.2 吸收光谱图

用紫外-可见分光光度计扫描不同体系的吸收光谱，结果见图2。

由图2可知，BPA在350～600 nm没有明显的紫外吸收峰(曲线1)，荧光黄在436 nm处有最大吸收(曲线2)；单独加入BPA时，体系的吸收光谱(曲线3)与曲线2基本重合，表明BPA不影响荧光黄的吸光度；在稀硫酸介质中，高温水浴加热条件下，溴酸钾氧化荧光黄，体系的吸光度下降(曲线4)；当同时存在溴酸钾和BPA时，体系在436 nm处的吸光度值比曲线4低，但氧化产物的末端吸收增加。随着BPA的加入量增多，荧光黄的吸收值越来越低，氧化产物的末端吸收越来越高，表明BPA能促进溴酸钾氧化荧光黄(曲线5、6)。当加入BPA后，体系在489 nm处有明显的共振散射峰(曲线7)，散射峰位置在吸收光谱最大吸收的长波区内，因而可以看作共振光散射峰。

图2 紫外吸收光谱(1～6)和共振光散射光谱图(7)Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum(1～6) and resonance light scattering spectra(7)1.H2SO4+BPA；2.H2SO4+FL；3.H2SO4+FL+BPA；4.H2SO4+FL+KBrO3；5～6.H2SO4+FL+KBrO3+BPA (0.8，2.0 μg/mL)；7.H2SO4+FL+KBrO3+BPA

2.3 实验条件优化

2.3.1 反应介质及用量的优化 分别考察盐酸、硫酸和磷酸等反应介质对体系共振光散射强度的影响。结果表明，ΔI盐酸>ΔI硫酸>ΔI磷酸，但由于使用盐酸作为反应介质时体系线性较差，且硫酸作为反应介质时体系稳定，最终选择硫酸为酸性介质。 探讨硫酸(0.10 mol/L)用量对体系ΔI值的影响，结果见图3。

图3 硫酸用量的优化Fig.3 Optimization of the H2SO4 dosage

由图 3可知，当硫酸体积为0.60 mL时，ΔI值达到最大；酸度太小时，氧化产物产生去质子化作用而成为中性分子，不能和溴酸根离子结合，ΔI值小；酸度过高时，溴酸根离子不能和氧化产物形成离子缔合物，ΔI值小。故0.60 mL的硫酸用量最佳。

2.3.2 荧光黄用量的确定 考察荧光黄溶液(1.0 ×10-4mol/L)用量对反应体系ΔI值的影响，结果见图4。

图4 荧光黄用量的优化Fig.4 Optimization of the FL dosage

由图4可知，当荧光黄体积为0.50 mL时，反应体系的 ΔI值达到最大；荧光黄体积小时，形成的聚集体少，ΔI值偏低；荧光黄过量，试剂空白大，ΔI值偏低。故本实验确定1.0 × 10-4mol/L 荧光黄溶液的最佳体积为0.50 mL。

2.3.3 氧化剂种类及其浓度的选择 分别比较H2O2、KBrO3、K2Cr2O7、KMnO4等氧化剂对反应体系的影响，结果见图5。

图5 氧化剂种类的选择Fig.5 Selection of oxidant types

由图5可知，KBrO3对荧光黄的氧化效果最佳。

考察KBrO3溶液(0.10 mol/L)用量对体系共振光散射强度的影响，结果见图6。

图6 溴酸钾体积的优化Fig.6 Optimization of the KBrO3 dosage

由图6可知，KBrO3的用量少时，形成的聚集体不够，反应时间长，ΔI值较小；KBrO3用量过多时，反应快，但空白值增加，ΔI值也偏小；KBrO3溶液用量为0.40 mL时，ΔI值达到最大，故本实验选择加入 0.10 mol/L KBrO3溶液 0.40 mL。

2.3.4 反应温度的影响 反应温度对体系ΔI值的影响见图7。

图7 反应温度的优化Fig.7 Optimization of the reaction temperature

由图7可知，催化体系和非催化体系在室温条件下，反应速率较慢，反应温度越高，体系反应速率越快，ΔI值也越高，温度为 70 ℃时，体系ΔI值达到最大；温度高于 70 ℃之后，ΔI值反而随着温度的升高而下降，这可能是因为非催化反应速度加快所致。故选用 70 ℃ 为最佳温度。

2.3.5 反应时间的影响 反应时间对实验的影响见图8。

图8 反应时间的优化Fig.8 Optimization of the reaction time

由图8可知，ΔI随反应时间的延长而逐渐变大，超过15 min后，ΔI值波动较小，并随着反应时间的延长而趋于稳定。因此反应时间选用15 min。在室温条件下，本体系催化和非催化反应缓慢，故选用流动自来水冷却终止反应。实验表明，体系在自来水流水冷却1 min后可迅速降至室温，且此时ΔI值最大。故本实验在70 ℃ 水浴15 min后，流水冷却1 min。

2.4 标准曲线、检出限和精密度

在优化后的最佳实验条件下，对不同浓度的BPA标准溶液进行测定，结果见图9。

图9 BPA测定的标准曲线Fig.9 The calibration curve for BPA determination

由图9可知，BPA浓度在 0.04～4.60 μg/mL范围内与共振光散射强度增大值ΔI呈良好的线性关系。标准曲线回归方程为：ΔI=8 842.4c+1 328.7，相关系数r=0.999 3。

根据IUPAC1998的规定，检出限LOD=3Sb/k，计算出BPA的检出限为0.019 μg/mL，其中Sb为空白测量的标准偏差(n=11)，k是分析曲线的斜率。分别平行测定11次低、中、高3种不同浓度的BPA样品 (0.40，2.00，3.00 μg/mL)，相对标准偏差分别为2.21%，1.98%，2.15%，可见本方法精密度良好。

2.5 样品测定及加标回收率

分别对市面上3个不同厂家的饮用水进行检测，均未检测出BPA。向这些水样品中分别加入0.40，2.00，3.00 μg/mL的 BPA 标准溶液进行加标回收实验，平行测定6次，结果见表1。

表1 样品中BPA的检测结果(n=6)

注：N.D.指未检出。

由表1可知，该方法的回收率为97.5%～103%，相对标准差RSD为2.51%～4.98%。

3 结论

利用双酚A对溴酸钾氧化荧光黄具有促进作用，且溴酸钾能同时氧化BPA，建立一种新的共振光散射法检测水中BPA。实验最佳条件为：向水样品中依次加入0.60 mL硫酸溶液(0.10 mol/L)，0.50 mL 荧光黄溶液(1.0×10-4mol/L)，0.40 mL溴酸钾溶液(0.10 mol/L)，70 ℃水浴加热反应15 min，流动自来水冷却(以终止反应)，在489 nm处测定共振光散射强度。方法的线性范围是：0.04～4.60 μg/mL，相关系数为0.999 3，检出限为0.019 μg/mL，回收率为97.5%～103%，RSD为2.51%～4.98%，方法具有较好的选择性，适用于水中双酚A的检测。