基于DCE-MRI Ktrans纹理分析评价四氧嘧啶诱导兔糖尿病早期骨骼肌变化

柳柏玉，查云飞，胡磊，陈翩翩，彭林，曾菲菲，杨柳，杨琪

糖尿病骨骼肌存在毛细血管网及内皮细胞功能紊乱、微血管屏障损伤、数目异常[1]及毛细血管白蛋白通透性增高[2]等改变，可引起一系列骨骼肌微结构损伤。以微循环为治疗靶点改善内皮功能、促进血管新生[3]等已成为糖尿病肌病防治的潜在策略。无创性定量评价微血管通透性及微结构变化对于揭示糖尿病骨骼肌病变病理生理机制和疗效评估都有着重要意义。

动态对比增强磁共振成像(dynamic contrast-enhanced MRI，DCE-MRI)无创监测终末器官血流灌注变化，其常用参数容量转移常数(volume transfer constant，Ktrans)可从定量角度反映包括骨骼肌在内的组织微血管渗透性[4]。纹理分析是一种包含数种技术来量化图像灰度或模式变化的新兴方法，研究表明其在预测下肢肌肉缺血中可起到一定作用[5]，基于MRI的纹理分析则可准确识别肌肉病变分布模式的细微差别[6-8]，以往研究对于图像纹理的提取多见于MRI常规序列如T1WI及T2WI，尚未见基于Ktrans图纹理分析评估糖尿病骨骼肌微结构变化的相关报道。本研究旨在采用基于DCE-MRI Ktrans纹理分析评价四氧嘧啶诱导兔糖尿病早期骨骼肌变化。

材料与方法

1.兔糖尿病模型的建立

本实验经武汉大学人民医院伦理委员会审查通过。由武汉大学动物实验中心提供健康成年雄性日本大耳白兔18只，空腹体重2.8～3.1 kg，平均(3.0±0.1) kg。所有兔适应性饲养1周后进行造模，造模前均禁食不禁水12 h，测量空腹血糖，血糖值均<6.0 mmol/L，平均(5.5±0.3) mmol/L。随机将兔分为实验组10只、对照组8只。将四氧嘧啶(Sigma公司)用0.9%的生理盐水配制成5%的溶液，按照100 mg/kg的剂量快速由耳缘静脉注入实验组兔体内，对照组则注入同等剂量的生理盐水，之后自由进食、进水。48 h后，用血糖仪(三诺安信血糖仪)测量外周血糖浓度。单次外周血糖测量值≥14 mmol/L或者两次测量值≥11 mmol/L被认定为造模成功[9]。随后4周内每周进行血糖水平监测。4周以后两组兔血糖水平趋于稳定。此后每隔4周行MRI检查前测量其血糖值。

2.MRI设备及成像方法

在造模成功后0、4、8、12、16周，对实验兔经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠溶液(1.3 mL/kg)进行麻醉。麻醉后将兔仰卧位足先进固定于8通道膝关节专用相控阵线圈，采用3.0T超导MR机(Discovery MR750 Plus，GE Healthcare)以兔腰6/7椎间盘中线水平为中心行多裂肌常规横轴面FSE-T1WI、FSE-T2WI及DCE-MRI检查。横轴面T1WI扫描参数：TR 400 ms，TE 9.6 ms，扫描层厚3.0 mm，视野12 cm×12 cm，矩阵256×256，激励次数为2.00，扫描时间1 min 11 s。横轴面T2WI扫描参数：TR 2500 ms，TE 121.7 ms，扫描层厚3 mm，视野12 cm×12 cm，矩阵256×256，激励次数为4.00，扫描时间2 min 25 s。DCE-MRI扫描参数：采用肝脏快速容积采集(liver acquisition volume acceleration，LAVA)序列及阵列空间敏感编码技术(array spatial sensitivity encoding technique，ASSET)。首先行多翻转角LAVA序列扫描(TR 3.5 ms，TE 1.6 ms，层厚3.0 mm，视野20 cm×16 cm，矩阵192×192，翻转角为9°及12°)，每个多翻转角序列扫描一个时相(8 s)。随后行动态增强LAVA序列扫描(TR 3.5 ms，TE 1.6 ms，层厚3.0 mm，视野20 cm×16 cm，矩阵192×192，翻转角10°)，连续无间隔同层扫描420帧动态图像，总计扫描35个时相，扫描持续时间为4 min 31 s。在基线扫描2个动态时相之后通过双筒高压注射器(Medrad Spectris Solaris EP Mobile Mount MR Injection System)经兔耳缘静脉团注欧乃影(钆双胺，GE Healthcare)，注射剂量为0.2 mmol/kg，注射流率1.0 mL/s，随后以同样流率注射0.9%生理盐水5 mL冲管。

3.DCE-MRI定量参数Ktrans及纹理分析

将DCE-MRI原始数据导入Omni-Kinetics (GE Healthcare)软件进行分析。首先对35期动态增强图像进行3D非刚性运动校正，以降低呼吸运动伪影，然后导入两个翻转角(9°和12°)LAVA序列图像，用于T1 mapping的计算，再将校正后的35期增强图像导入，拟合腹主动脉内的对比剂时间-浓度曲线作为多裂肌的动脉输入函数(arterial input function，AIF)，药代动力学模型选择双室模型(Extended Tofts Linear)。在图像每一层面同侧多裂肌区手动勾画兴趣区(ROI)，避开皮下脂肪层、筋膜、椎体骨，采用merge功能将每个层面ROI图像融合为三维兴趣区(VOI)，软件自动计算出Ktrans(取平均值)，同时于Ktrans图提取灰度共生矩阵(GLCM)的5个常用参数能量、熵、自相关、逆差矩及对比度。相同方法测出对侧多裂肌Ktrans值及相应纹理参数，重复测量三次取各参数平均值为最终结果。

4.组织病理学检查

在第16周完成MRI检查后，采用空气栓塞法处死所有兔，取腰6/7椎间盘中心层面水平多裂肌，采用环保型GD固定液(肌肉专用)固定，石蜡包埋，垂直肌纤维走行作4 μm厚薄切片，行HE染色及CD31免疫组化染色。在光学显微镜(OLYMPUS BX51)下观察切片并拍片，采用Image Pro-plus 6.0软件对图像进行分析。每个肌肉标本HE染色切片在高倍镜下(×200)选择4个视野拍照，每幅图像随机选取约50根肌纤维，总共选取约200根肌纤维数[10]，计算单根肌纤维平均横截面积(cross sectional area，CSA)。CD31免疫组化染色切片在镜下选取4个独立的相同面积区域拍照，根据这些区域的微血管数目计算微血管密度(microvessel density，MVD)(微血管数目/mm2)和毛细血管数/肌纤维数(capillary-to-fiber ratio，C/F)[11]。任何与邻近微血管及其它结缔组织分离的棕黄色内皮细胞或细胞团可作为单根微血管。

5.统计学分析

结 果

糖尿病组、对照组不同时间点Ktrans、熵、自相关、逆差矩、对比度差异比较采用重复测量的方差分析，其中糖尿病组Ktrans、熵、逆差矩、对比度差异具有统计学意义(F值分别为33.563、16.790、19.128、3.577，P均<0.05)，两两比较采用Bonferroni法。糖尿病组自相关差异无统计学意义(F=3.024，P=0.068)。能量差异比较采用Friedman检验，在糖尿病组差异具有统计学意义(P=0.022)。糖尿病组Ktrans及熵第8、12、16周较第0、4周升高，逆差矩第8、12、16周较第0、4周减低(P均<0.05)，Ktrans在第8周以后出现降低趋势，第16周与第8周比较差异具有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组对比度第8周较第0周升高(P<0.001)，能量第8周较第4周减低(P=0.047)。对照组Ktrans、熵、自相关、逆差矩、对比度及能量差异均无统计学意义(P均>0.05)。同一时间点与对照组相比，糖尿病组第8、12及16周GLCM参数熵升高，逆差矩降低(P均<0.05)；糖尿病组第8周能量降低(Z=-2.310，P<0.05)，对比度增高(t=2.374，P<0.05)。自相关在两组间差异均无统计学意义(P均>0.05)(表1、图1及图2)。

表1 糖尿病组、对照组各时间点Ktrans值及灰度共生矩阵参数比较结果

注：a为Z值；*及b分别代表组内Ktrans、灰度共生矩阵参数与第0周、第8周比较差异具有统计学意义；#代表同一时间点糖尿病组与对照组间Ktrans、灰度共生矩阵参数差异具有统计学意义。

与对照组相比，第16周糖尿病组多裂肌HE染色显示肌纤维明显萎缩，CD31免疫组化染色显示肌纤维间微血管稀疏(图3)。糖尿病组、对照组CSA平均值分别为(3330.523±563.328) μm2、(5818.343±322.531) μm2；MVD平均值分别为(253.854±19.093)/mm2、(187.576±17.013)/mm2；C/F平均值分别为0.580±0.064、1.079±0.101。糖尿病组多裂肌CSA、C/F值低于对照组(t值分别为-11.081、-12.812，P均<0.001)，MVD值高于对照组(t=7.672，P<0.001)。Pearson相关分析结果显示Ktrans与C/F呈负相关(r=-0.809，P<0.05)，而与MVD呈正相关(r=0.681，P<0.05)。

讨 论

本研究首次采用基于DCE-MRI Ktrans纹理分析评价四氧嘧啶诱导兔糖尿病早期骨骼肌变化，研究结果显示糖尿病兔多裂肌存在微血管渗透性改变，并与骨骼肌微血管密度及毛细血管数/肌纤维数存在一定相关性，且基于Ktrans图的GLCM参数可识别糖尿病早期细微结构的变化。

本实验选取兔腰部多裂肌作为研究对象，主要由于多裂肌位于脊柱背侧最内侧，是维持腰骶区域稳定性最重要的肌肉，其水肿、萎缩及脂肪浸润则与下腰痛、脊柱畸形等有关[12]。微血管屏障损伤与糖尿病终末器官并发症的发生和进展有关，糖尿病早期阶段包括骨骼肌在内的多种组织存在血浆渗漏。本研究发现糖尿病组多裂肌早期Ktrans较对照组升高，表明了糖尿病骨骼肌微血管渗透性增加，与以往研究结果一致，其可能机制为持续高血糖状态下，多元醇通路及蛋白激酶C(PKC)信号通路的激活、晚期糖基化终末产物形成、氧化应激反应及炎症反应等因素可影响物质通过内皮屏障时的跨细胞途径和细胞旁途径，导致微血管屏障受损，从而引起微血管通透性增高。Ktrans还反映了微循环血流量及血管表面积相关信息，本研究发现第8周以后糖尿病组Ktrans虽仍高于对照组，但组内出现了降低趋势，其原因则可能与微血管血流灌注发生改变有关。本研究发现第16周糖尿病组MVD较对照组增高，CSA及描述肌纤维毛细血管供应的C/F值较对照组均降低，表明糖尿病组MVD升高可能因肌纤维萎缩所致，C/F值的降低则反映了骨骼肌纤维血供减少，微血管稀疏，与以往研究结果一致[13-14]。本研究显示C/F值与Ktrans呈高度负相关，提示肌纤维血供可能对Ktrans的变化产生一定影响。此外，糖尿病骨骼肌还存在毛细血管网血流量及微血管长度密度减低[15]、管腔狭窄等改变，造成骨骼肌微血管灌注减低[16]，从而可能导致了本研究中糖尿病组第8周以后Ktrans的减低。

GLCM的能量(又称为角二阶矩)、熵、自相关、逆差矩及对比度纹理特征参数不仅在分析肿瘤异质性方面应用较多[17]，在识别骨骼肌微结构变化方面也展现了较高的价值。纵向研究显示腰椎管狭窄症患者步行距离能力(临床症状指标)的降低与L3/4层面椎旁肌横轴面T2WI图像的GLCM参数熵存在一定相关性，而与传统的定性Goutallier分级系统无相关性，提示熵在反映肌肉微结构变化方面可能存在一定优势[6]。Watanabe等[18]研究显示老龄化的下肢骨骼肌超声图逆差矩及角二阶矩均减低。本研究发现第8、12及16周糖尿病组熵值均较第0、4周增高，且高于对照组，而逆差矩均减低，表明造模成功一定时间后糖尿病组Ktrans图纹理的复杂程度及不规则性增加，同时也提示了基于Ktrans图的GLCM参数熵和逆差矩是识别糖尿病早期骨骼肌微结构变化的重要参数，与以往研究结果具有相似性。

图1 第16周糖尿病组。a)增强T1WI图，红色区域为某一层面左侧多裂肌ROI；b)对应区域的Ktrans伪彩图，左侧多裂肌Ktrans值为2.397/min。 图2 第16周对照组。a)增强T1WI图，红色区域为某一层面左侧多裂肌ROI；b)对应区域的Ktrans伪彩图，左侧多裂肌Ktrans值为1.125/min。

图3 第16周糖尿病组、对照组HE染色及CD31免疫组化染色结果。a)糖尿病组多裂肌横截面肌纤维(箭)，肌纤维萎缩染色(×200，HE)；b)对照组多裂肌截面肌纤维(×200，HE)；c)镜下见糖尿病组肌纤维周围微血管(箭)稀疏(×200，CD31免疫组化染色)；d)镜下见对照组肌纤维周围微血管(箭)分布正常(×200，CD31免疫组化染色)。

尽管纹理分析和组织病理学所反映的微观尺度不同，但二者在很大程度上存在一定联系。Mahmoud-Ghoneim等[19]研究显示基于T1WI图像的纹理分析可鉴别大鼠腓肠肌三种不同状态：正常、固定后肌萎缩和恢复状态，其中角二阶矩和熵最具判别性，这与肌萎缩时Ⅱ型纤维(快缩纤维)的平均横截面积减小有关。Martins-Bach等[20]研究发现基于T2WI图像的对比度和熵可识别不同肌肉营养不良症模型小鼠腿部肌肉纹理的细微差异，与肌纤维退化、再生、炎性细胞浸润、纤维化程度及分布模式的不同密切相关。本研究显示糖尿病组肌纤维横截面积减小、微血管稀疏。Amin等[21]研究显示糖尿病动物模型骨骼肌存在结构变形、肌纤维普遍萎缩、间隙增宽、肌纤维间及血管周围间质结缔组织增多，与本研究结果部分一致。此外，微血管内皮形态异常、管腔狭窄也是糖尿病骨骼肌特点之一。这些因素可能导致了本研究中对比剂在糖尿病肌组织内渗出的不均性增加，从而造成图像纹理局部变化加大、复杂程度增高，因而熵值增高、逆差矩减小。

此外，本研究显示自相关在不同时间点两组组内及同一时间点组间均无显著差异，而仅第8周可见糖尿病组能量较第4周减低，且低于对照组，对比度较第0周增高，且高于对照组，表明第8周糖尿病组Ktrans图邻近像素灰度差别较明显，图像纹理不均匀性增加，可能与第8周糖尿病组Ktrans值最大，微血管通透性较高有关。

本研究的局限性：①糖尿病为慢性代谢性疾病，本研究时长仅为16周，骨骼肌微结构及微血管渗透性随时间变化趋势有待进一步研究。②病理方面并未对微血管管腔直径等影响血流灌注的因素及肌纤维分型作进一步研究。③实验样本量较小，糖尿病骨骼肌微结构及微血管通透性变化机制仍需大样本研究予以证实。

综上所述，DCE-MRI定量参数Ktrans可用于评估糖尿病骨骼肌微血管渗透性改变，基于Ktrans图的GLCM参数可识别糖尿病早期骨骼肌微结构变化。