二维液相色谱同时测定婴幼儿配方乳粉中多种脂溶性维生素

赵玉富，刘晓玲，咸伟玥，王剑飞，单艺

（1.黑龙江省质量技术监督检测研究院，哈尔滨1500501；2.东北农业大学黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨150028）

0 引 言

婴幼儿配方乳粉是指以乳类及乳蛋白制品和/或大豆及大豆蛋白制品为主要原料，加入适量的维生素、矿物质和/或其他辅料，仅用物理方法生产加工制成的粉状产品[1-2]婴幼儿配方乳粉的营养成分及含量一般都参照母乳进行合理的配方加工生产。近年来婴幼儿配方乳粉的营养成分和产品质量备受关注，2016年3月15日经国家食品药品监督管理总局局务会议审议通过《婴幼儿配方乳粉产品配方注册管理办法》，2016年6月6日发布，10月1日实施。2019年2月1日，市场监督管理总局发布《市场监督管理总局关于印发2019年食品安全监督抽检计划的通知》明确每月对全部已获配方注册且在售的国产和进口婴幼儿配方乳粉生产企业的产品进行抽检，所以婴幼儿配方乳粉中维生素的检测一直是生产企业和质检部门的重点工作。国家标准检验方法中对于维生素A、维生素E采用GB 5009.82-2016第一法，维生素D2、维生素D3采用GB 5009.82-2016第四法，β-胡萝卜素的检验采用采用GB 5009.83-2016，实际检验效率很低[3-4]。

婴幼儿配方乳粉中维生素A、维生素E、维生素D2、维生素D3及β-胡萝卜素均为脂溶性维生素，检验提取过程相同，但是其中维生素A、维生素E、β-胡萝卜素为反相高效液相色谱法检测，维生素D2、维生素D 3为正相高效液相色谱半制备后由反相高效液相色谱检测，操作过程繁琐。由于婴幼儿配方乳粉中存在从纳克到毫克级不同含量水平的维生素，各维生素化学性质的差异使得所有维生素的共同提取和分析极具挑战，此前安捷伦应用解决方案和文献有同时检测多种脂溶性维生素的方法[5-13]。但针对婴幼儿配方乳粉的前处理过程不能满足国标要求。

近年二维液相色谱法发展迅速，由于其能实现在一维色谱柱分离复杂基质的微量目标物并直接切换到二维色谱柱进行精确测定，实现了样品的在线净化，提高了分析灵敏度，成为了复杂基质样品检测的发展趋势。本文采用双泵双检测器系统以六通阀切换一维色谱柱的分离物经捕获柱进入二维色谱柱检测实现同时测定婴幼儿配方食品中的五种脂溶性维生素。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

二维液相色谱系统及其色谱工作站（1260 Infinity-2D，Agilent Technologies美国，配备双二极管阵列检测器），电子分析天平（BSA 2202S 0.01 g、BT 25S 0.01 mg赛多利斯），恒温搅拌水浴锅（HL-9、上海浦东物理光学仪器），旋转蒸发仪（RE-52AA、上海亚荣生化仪器）维生素A标准物质（纯度95.0%，Dr Ehrenstorfe），β-胡萝卜素标准物质（纯度93.0%，Dr Ehrenstorfe），维生素D2标准物质（纯度98.0%，Dr Ehrenstorfe），维生素D3标准物质（纯度99.9%，Dr Ehrenstorfe），维生素E标准物质（dl-α-生育酚，纯度98.0%，Dr Ehrenstorfe），甲醇（色谱纯，Fisher Chemical），乙腈（色谱纯，Fisher Chemical），石油醚（沸程30～60分析纯，科密欧），无水乙醇（分析纯，科密欧），氢氧化钾（分析纯，西陇科技），抗坏血酸（分析纯，西陇科技），2，6-二叔丁基対甲酚（分析纯，西格玛），试验用水为超纯水。婴幼儿配方乳粉（市售）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件的选择

C18色谱柱为国标检验分析脂溶性维生素选择，考虑到检验的分离效果和时间成本本实验选择Agilent Technologies InfinityLab Poroshell 120 EC-C8作为一维分离柱，C8相对于C18有着更快的分离时间，而Poroshell 120系列色谱柱采用安捷伦公司专利的制造工艺，在实心核外包上表面多空层，能显著提高被分析物在固定相和流动相之间的传质，使其在较低反压下实现快速高效的分离。二维色谱柱选择Agilent Technologies Zorbax Eclipse PAH考虑到分离维生素D2和维生素D3的分离度，在相同流动相条件下PAH色谱柱可通过降低柱温实现维生素D2和维生素D3的基线分离。

维生素A、维生素E、维生素D2、维生素D3均能溶解于甲醇、乙腈中，而β-胡萝卜素不溶于甲醇、乙腈，易溶于三氯甲烷、四氢呋喃。实验选择乙腈/甲醇/四氢呋喃（75∶25∶5，体积比）溶解样品提取物能同时溶解5种被测维生素。同时对于一维色谱柱的分离需要进行梯度洗脱，三氯甲烷与水不混溶，因此在同时分离维生素A、维生素E、维生素D2、维生素D3及β-胡萝卜素时选择乙腈/甲醇/四氢呋喃作为流动相。对于一维色谱柱必须以梯度洗脱使维生素A的出峰时间延后使其与干扰物质分离，对于二维色谱柱比较流动相对维生素D2和维生素D3分离效果的影响，实验发现使用纯甲醇作为二维流动相时目标物响应值最高，以甲醇为流动相会造成目标物出峰过快，因此二维色谱柱选用柱长250 mm的色谱柱。

维生素A、维生素E和β-胡萝卜素在婴幼儿配方乳粉中含量较高，维生素D2和维生素D3含量较低，且样品基质干扰较大，原标准方法需经过正相制备色谱的净化，将含有维生素D2和维生素D3的馏分蒸干定容后，再在反相色谱上进行分析。本研究采用二维色谱分离的中心切割法，样品在一维色谱柱实现初步分离后，将含有维生素D2和维生素D3的馏分切割至二维色谱柱中进行分离。系统连接图（见图1）。为确定阀的准确切换时间，实验将关闭阀切换命令使一维色谱柱直接与一维检测器连接，进标准品溶液，测定维生素D2和维生素D3的出峰时间起点和终点。由于使用捕获柱收集一维色谱柱的维生素D2和维生素D3的馏分，而捕获柱柱容量小，需要考虑在阀切换的时间段内捕获柱是否能完全将维生素D2和维生素D3收集到。由图1可知影响维生素D2和维生素D3是否被完全收集的因素主要有两点，一是一维色谱柱对维生素D3的分离效果，二是一维泵系统的流速设计，实验中我们内径3.0 mm、填料粒径2.7μm的一维色谱柱，流速为0.6 mL/min，由标准品测试确定出阀切换时间为7.80 min更改阀的位置端口1-＞6，8.90 min更改阀的位置端口1-＞2。

一维条件：Agilent Technologies InfinityLab Poroshell 120 EC-C8（3.0 mm×150 mm，2.7μm），流速为0.6 mL/min梯度洗脱，洗脱程序见表1。一维DAD检测器采用波长切换方式检测（VA∶326 nm；VE∶285 nm；β-胡萝卜素450 nm）。二维条件：Agilent Technologies Zorbax Eclipse PAH（4.6 mm×250 mm，5μm），流速为0.3 mL/min，流动相为甲醇。二维DAD检测器检测（VD2VD ∶3264 nm），柱温均为25℃，进样量为10μL，阀切换时间为7.80 min更改阀的位置端口1-＞6，8.90 min更改阀的位置端口1-＞2。捕获柱为SB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5μm）。

图1 二维液相阀切换流路示意图

表1 一维液相梯度洗脱程序

1.2.2 标准溶液配制

分别称取一定量的维生素A、维生素E、维生素D3标准品于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀。经校正维生素A贮备液浓度为500μg/mL；维生素E标准贮备液浓度为1 000μg/mL；维生素D2贮备液浓度为100μg/mL；维生素D3贮备液浓度为100μg/mL；称取一定量的β-胡萝卜素标准品于100 mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀释至刻度，混匀，经校正β-胡萝卜素贮备液浓度为500μg/mL；分别移取上述标准溶液工作液适量，以流动相B乙腈/甲醇/四氢呋喃（75∶25∶5，体积比）稀释成混合工作液，维生素A工作液浓度为20.0μg/mL；维生素E标准工作液浓度为200μg/mL；维生素D2工作液浓度为1.00μg/mL；维生素D3工作液浓度为1.00μg/mL；β-胡萝卜素工作液浓度为10.0μg/mL。将维生素A、E、D2、D3、β-胡萝卜素混合标准工作液稀释成标准曲线工作液。

1.2.3 样品测定

根据相关国家标准称取婴幼儿配方乳粉样品5.00 g（精确至0.01 g）于250 mL锥形瓶中，加入1 g抗坏血酸，50 mL温度50℃的水充分溶解样品，加入0.5 g木瓜蛋白酶，盖上瓶塞于55℃的水浴中磁力搅拌30 min。向预处理后的试样中加入80 mL无水乙醇和30 mL氢氧化钾溶液，盖上瓶塞于55℃的水浴中磁力搅拌回流皂化30 min。将皂化液移至500 mL分液漏斗中，以石油醚萃取两次次，每次100 mL，合并萃取液，萃取液以水洗涤至中性，收集石油醚层，经过无水硫酸钠脱水后转移至旋蒸瓶中。40℃旋蒸至近干，取下氮气吹干，再以流动相B乙腈/甲醇/四氢呋喃（75∶25∶5，体积比）溶解并转移定容至10 mL作为待测液。

2 结果

2.1 方法线性范围与精密度

按照2.2.2标准曲线配制维生素A、E、D2、D3、β-胡萝卜素标准曲线，并对维生素A、E、D2、D3、β-胡萝卜素加标样品重复进样六次，以峰面积计算方法精密度，方法精密度良好，标准曲线范围、线性方程及精密度见表2。

表2 标准溶液线性关系与精密度

2.2 样品分析结果

按照2.2.3样品测定方法对婴幼儿配方乳粉样品进行分析，标样谱图见图2，样品分析谱图见图3，采用波长切换模式在一维检测器中同时测定的维生素A、维生素E及β-胡萝卜素出峰位置无干扰峰，二维检测器中的维生素D2和维生素D3与干扰峰分离度很高，不会对结果造成影响。

图2 维生素A、维生素E、维生素D 2、维生素D3及β-胡萝卜素标样谱图

图3 样品中维生素A、维生素E、维生素D2、维生素D 3及β-胡萝卜素谱图

表3 样品测试结果与加标实验结果

2.3 国标法与本研究的比较

对市售婴幼儿配方乳粉中维生素质控样品进行测试并同时对实验样品的五种维生素做加标实验数据见表3，实验样品中不含维生素D2，其余4种维生素实测值偏差5种维生素加标回收率在90%～98%之间。结果表明该方法准确度较高。

3 结 论

本方法实现维生素A、维生素E、β-胡萝卜素及维生素D2、维生素D3同时检测，并且维生素D2与维生素D3分离度高，相对于正相高效液相色谱半制备检测分析时间缩短为25 min，免去了正相制备过程的大量试剂消耗。方法线性范围为：维生素A为0.0945μg/mL～14.17μg/mL，维生素E为1.21μg/mL～181.5μg/mL，β-胡萝卜素为0.0163μg/mL～2.445μg/mL，维生素D2为 0.0163μg/mL～2.445μg/mL，维生素 D3为0.0150μg/mL～2.500μg/mL，相关系数 r均大于0.999。本方法实现了5种维生素同时检测，重现性好，准确度高，为婴幼儿配方乳粉中维生素含量测定提供了参考。