某地区养殖户家禽禽流感的实验室诊断

田启会

摘  要：为了防止禽流感的大规模暴发，减轻对人类健康的影响，本试验采用荧光免疫层析法对某地区养殖户的100羽患病鸡进行诊断。结果显示，通过H5亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条检测，该地区的100羽疑似患病鸡样本中，H5N1、H5N2亚型禽流感抗原检出阳性，而H9N2亚型禽流感抗原、H6N6亚型禽流感抗原结果为阴性;能检出H5N1、H5N2亚型禽流感病毒抗原100倍的稀释度;10次检测H5N1亚型禽流感抗原的变异系数为0.95%（P<0.05），差异不显著。此次诊断表明，该地区存在H5N1和H5N2型禽流感，不存在其他血清型的禽流感。

关键词：禽流感;间接荧光免疫试验;预防;饲养管理

中图分类号：S855 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2019）06-0058-02

1  材料与方法

1.1 采样

笔者于2018年4月份在某地区家禽养殖户中采集家禽样本，采集对象为散养鸡（养殖规模几百到一千羽不等）。每羽鸡的泄殖腔拭子和鸡喉拭子样各采集2份，每户选取2羽患病鸡，共50户养殖户，总计400份样品。用磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）保存于-20 ℃，运输时将其放置于干冰环境中。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

荧光检测仪由深圳市易瑞生物技术有限公司提供，批号为：20130509。

1.2.2 试剂

H5N1亚型禽流感抗原为哈尔滨生物制品六厂责任有限公司产品，批号为：20150208。H5N2亚型禽流感抗原为哈尔滨生物制品二厂责任有限公司产品，批号为：20150403。H9N2亚型禽流感抗原由武汉博沃生物科技有限公司提供，批号为：20160520。H6N6亚型禽流感抗原为哈尔滨兽研所产品，批号为：06606-050412。H5亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条由武汉博沃生物科技有限公司提供，批号为：20160709。

1.3 方法

1.3.1 特异性试验

用2 mL PBS液分别溶解H5N1亚型禽流感抗原、H5N2亚型禽流感抗原、H6N6亚型禽流感抗原、H9N2亚型禽流感抗原，并用PBS液将其按1∶10的比例进行稀释，然后用移液器吸取75 μL的稀释液加入H5亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条上，15 min后，用荧光检测仪读出数值。结果判定标准：若cut off值≥80判为阳性，若<80则判为阴性。

1.3.2 敏感性试验

分别用PBS液稀释10倍、100倍、1 000倍H5N1亚型禽流感抗原和H5N2亚型禽流感抗原，然后用移液器吸取75 μL稀释液加入H5亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条上，    15 min后，用荧光检测仪读出数值。结果判定标准为：若cut off值≥80判為阳性，若<80则判为阴性。

1.3.3 变异系数试验

用PBS液稀释100倍H5N2亚型禽流感抗原，用移液器吸取75 μL加入H5亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条上，15 min后，用荧光检测仪读取数值。结果判定标准为：若cut off值≥80判为阳性，若<80则判为阴性。

2  结果

2.1 特异性试验结果

试验中，用H5亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条检测得到不同的毒株抗原，得出的试验结果为H5N2亚型禽流感抗原、H5N1亚型禽流感抗原的检测结果为阳性，H9N2亚型禽流感抗原、H6N6亚型禽流感抗原检测结果为阴性，见表1。试验结果表明，H5亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条可以准确检测出H5N1、H5N2两种亚型流感病毒，其中H5亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条的特异性较强。

2.2 敏感性试验结果

H5亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条能够检测出10倍和100倍稀释的H5N1亚型禽流感抗原，而稀释1 000倍以后的检测结果为阴性;稀释10倍和100倍的H5N2亚型禽流感抗原最终检测结果为阳性，而稀释1 000稀释倍以后检测结果则为阴性，见表2。试验结果表明，H5亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条能够检出H5N1、H5N2亚型禽流感抗原的最大稀释倍数为100倍。

2.3 变异系数试验结果

试验中，H5亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条检测得出10次1∶100稀释的H5N1亚型禽流感抗原，检测结果10次均为阳性，见表3。而变异系数为0.95%，结果差异并不明显。试验结果显示，H5亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条检测结果相对稳定。

3  结论

通过对该地区100羽鸡的400份检疫样品进行荧光免疫检测，得出该地区的400份检疫样品均存在H5N1、H5N2型禽流感病毒，所以我们需要对该地区的H5N1、H5N2型禽流感进行针对性免疫预防工作。由于禽流感具有发病快、传播迅速、死亡率高等特征，因此日常管理中应遵循防重于治的原则，并且在养殖过程中实施“全进全出”的养殖制度，注意鸡舍的选址、鸡舍的卫生环境以及养殖场工作人员的管理水平。我国关于禽流感方面的研究工作虽然已走在了世界前列，但是禽流感的检测与预防工作还有很大的进步空间，这其中仍有重要的科学问题没有得到解决，在应用和推广方面也有不足，科研人员和兽医工作者依然任重道远。□□