VEGF-A、VEGF-C在口腔疣状癌和口腔鳞状细胞癌中的表达

陈 芬，郭凌燕，李 羽，陈林林

(南昌大学附属口腔医院口腔颌面外科、江西省口腔生物医学重点实验室，南昌 330006)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤，其易发生区域淋巴结转移，预后相对较差[1]。口腔疣状癌(oral verrucous carcinoma，OVC)是鳞状细胞癌的疣状变异型，生长方式为局部推进，生长缓慢，转移发生在后期或不转移，预后相对较好。OSCC与OVC呈现出的不同临床和显微病理特征反映出其不同的生物学行为和预后。

以往学者做了大量的研究,以明确参与OVC发病机制的活性分子。MOHTASHAM等[2]对p53、Ki-67、MMP-2、MMP-9进行了组织化学分析,发现这些蛋白可以在肿瘤侵袭前期用于鉴别OSCC和OVC。Bcl-X和细胞周期蛋白D1也被发现在OVC中有差异表达[3-4]。HARISHANKAR等[5]发现Notch4下调可作为OVC可靠的预后标记,但是在肿瘤细胞增殖活性的研究上，VALLONTHAIEL等[6]发现pRb、p16和p27蛋白在OSCC和OVC之间没有明显区别。导致两者明显不同的生物学行为的相关病理因素仍然不完全清楚。本研究基于OSCC和OVC两者的临床病理特征不同，比较评价血管内皮生长因子A(VEGF-A)和血管内皮生长因子C(VEGF-C)在OSCC和OVC中的表达，以探讨OSCC和OVC不同临床生物学特征可能的内在原因。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集南昌大学附属口腔医院2005—2013年经手术切除并经病理诊断确诊为口腔疣状癌26例(OVC组，发生于下唇12例、牙龈6例、颊黏膜3例、口底2例、舌2例、磨牙后区1例)、口腔鳞状细胞癌21例(OSCC组，发生于牙龈9例、颊黏膜8例、口底2例、舌1例、磨牙后区1例)组织标本以及6例正常口腔牙槽黏膜(对照组)组织标本。根据口腔癌的国际抗癌联盟(UICC)第7版TNM分类分期方法对病例进行临床分期，其中口腔疣状癌Ⅰ期9例，Ⅱ期13例，Ⅲ期4例；口腔鳞癌Ⅰ期8例，Ⅱ期8例，Ⅲ期5例。口腔疣状癌无淋巴结转移病例，口腔鳞癌的5例Ⅲ期病例均为颈淋巴转移。排除标准：发生于口腔外其他部位的疣状癌和鳞癌，病史不详的患者，手术前接受过放疗、化疗或其他治疗的患者。每个蜡块行3 μm厚连续切片5张。本研究已获得南昌大学附属口腔医院伦理委员会同意和患者知情同意。

1.2 试剂与材料

即用型VEGF-A兔抗人多克隆抗体(4 μg·mL-1)、VEGF-C鼠抗人单克隆抗体(4 μg·mL-1)，均购自SantaCruzBiotechnology公司；快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物(KIT-5030)，DAB显色试剂盒(DAB-0031),免疫组化防脱片剂多聚赖氨酸(GLU-0040)均购自福州迈新生物技术有限公司。无水乙醇、二甲苯、中性树胶等为国产市售产品。

1.3 免疫组织化学检测

蜡块常规切片(厚3 μm)采用MaxvisionTM2/HRP法对组织切片进行VEGF-A、VEGF-C免疫组化染色。用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，选用VEGF-A和VEGF-C高表达的乳腺癌肿瘤细胞作为阳性对照。

1.4 结果判定

由两位有经验的病理科医生采用统一评分标准和单盲法对所有染色结果进行判定，评分过程均重复2次以上。观察者事先不知道所观察切片的任何临床信息。

VEGF-A、VEGF-C阳性判定标准:细胞阳性表达所占百分率为0%、1%～10%、11%～30%、31%～50%、51%～100%，分别计作0、1、2、3、4分；根据肿瘤细胞与间质细胞的着色深浅对比，来判断染色强度，无着色为0分、轻度着色为1分、中度着色为2分、重度着色为3分。将两项得分相加，定为染色结果，若总分≥3，则认为VEGF-A或VEGF-C阳性[7]。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件，计数资料比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF-A表达比较

VEGF-A蛋白主要位于细胞浆内,阳性着色为棕黄色或棕褐色,也可见细胞膜着色,肿瘤边缘着色更深(封三图1A—C)。OSCC组VEGF-A表达阳性率明显高于OVC组及对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 VEGF-A在3组组织中的表达比较 例

#P<0.05与OSCC组比较。

2.2 VEGF-C表达比较

VEGF-C蛋白主要位于细胞浆内,阳性着色呈棕黄色或棕褐色(封三图1D—E)。OSCC组VEGF-C表达阳性率均明显高于OVC组及对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 VEGF-C在3组组织中的表达比较 例

#P<0.05与OSCC组比较。

3 讨论

口腔疣状癌是鳞状细胞癌的疣状变异型，生长方式为局部推进，生长缓慢，后期发生转移或不转移，预后相对较好。随着对口腔疣状癌的进一步研究，发现其生物学行为具有多样性，唐瞻贵等[8]将口腔疣状癌分为外生型、浸润型和囊肿型，并发现口腔角化囊性瘤、口腔疣状白斑和口腔扁平苔藓可恶变发展为口腔疣状癌。有少部分口腔疣状癌发展迅速，甚至早期发生淋巴结转移，因此，研究口腔疣状癌与口腔鳞状细胞癌不同的发生发展机制，对临床上口腔疣状癌患者选择更合适的治疗手段具有重要意义。

尽管目前大多数学者认为VEGF-A、VEGF-C与恶性肿瘤的脉管新生关系密切，但在各类肿瘤的研究中，两者与肿瘤局部生长、局部淋巴结转移或远处器官转移之间关系的研究结果还是存在着差异[9-11]。

肿瘤患者体内存在多种血管生成刺激因子,在众多血管生成刺激因子中，VEGF被认为是最重要的始动因子。1989年,FERRARA等[12]首次从牛脑垂体滤泡星状细胞体外培养液中将VEGF-A纯化出来，研究证明,VEGF-A在增加微血管渗透性的同时，还能使内皮细胞发生有丝分裂，从而促进内皮细胞增殖，形成新生微血管，因此，VEGF-A的表达水平可以反应组织血管生成的能力。

与血管内皮生长因子相结合的受体是特异性酪氨酸蛋白激酵受体(receptor tyrosine kinase,RTK)超家族,即受体VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。其中VEGFR-1、VEGFR-2位于血管内皮表面，VEGFR-3位于淋巴管内皮表面，VEGF-A主要与VEGFR-1、VEGFR-2相结合，作用于血管内皮，主要诱导血管生成。VEGF-C与VEGFR-2、VEGFR-3相结合，但其与VEGFR-3相结合的亲和力比VEGFR-2高3倍多，优先与VEGFR-3相结合，所以VEGF-C的主要作用是诱导淋巴管生成[13-15]。

有研究[16-17]表明在多种肿瘤中VEGF都有高表达，如肺癌、胃癌、食道癌、喉癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌及膀胱癌。YANASE等[18]的研究发现在口腔鳞状细胞癌中，VEGF-A表达与淋巴结转移显著相关，VEGF-C与淋巴结转移、复发、5年生存率相关。本研究结果表明,在口腔疣状癌组织中VEGF-A阳性表达率为42.31%(11/26),VEGF-C阳性表达率为11.54%(3/26)；口腔鳞状细胞癌组织中VEGF-A阳性表达率为71.43%(15/21),VEGF-C阳性表达率为52.38%(11/21)；而在正常口腔黏膜组织中VEGF-A低表达，阳性表达率为16.67%(1/6)，VEGF-C无表达。VEGF-A及VEGF-C在口腔鳞状细胞癌组织中的表达明显高于口腔疣状癌组织和正常口腔黏膜组织，提示VEGF-A及VEGF-C的高表达可能是促进口腔鳞状细胞癌发生、发展的重要因素，可能影响其生物学行为及其转移潜能，导致口腔鳞状细胞癌较口腔疣状癌更易发生局部复发及区域性淋巴结转移。