右归饮对轻微中枢神经损伤模型大鼠海马组织细胞自噬表达的影响

邹 阳 王昌兴

轻微中枢神经损伤是由交通车祸、体育运动等造成的脑、脊髓轻度挫伤。虽然中枢神经轻微伤的严重程度较其他的闭合性神经损伤要轻，但仍会引起细胞变性和凋亡，逐步影响患者认知和运动协调能力[1]。由于病理机制尚未明确，且神经细胞再生能力较差，故缺乏有效的治疗手段。轻微中枢神经损伤属中医“神志病”范畴，辨证为肾阳亏虚。故治疗宜温阳补肾，填精益髓。研究证实，右归饮可以抑制神经细胞的凋亡[2]。本研究观察右归饮对轻微中枢神经损伤模型大鼠海马组织细胞自噬相关基因和蛋白的表达，及海马组织细胞形态改变的影响。

1 实验材料

1.1 动 物 雄性Sprague Dawley大鼠48只，清洁级，4周龄，初始体质量85～95g。所有大鼠购自中科院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司（动物生产合格证：SCXK（沪）2012-0002），大鼠的饲养与实验操作均于浙江中医药大学动物实验中心完成（动物实验使用许可证：SYXK（浙）2013-0184）。

1.2 药 物 实验用中药购自浙江中医药大学附属第二医院名中医分馆，并于中药室内制备。根据《景岳全书》，方剂右归饮由熟地黄9g，山药6g，山茱萸、肉桂各3g，制附子9g，姜杜仲、枸杞各6g，炙甘草3g组成，通过浓缩、干燥后制成细粉，并溶解于生理盐水中至0.69g/mL备用。

1.3 试剂及仪器 抗Beclin-1抗体购自北京博奥森公司（兔抗，批号AF07044415）；抗mTOR抗体购自北京博奥森公司（兔抗，批号AF12262669）；抗LC3抗体购自北京博奥森公司（兔抗，批号AF10285813）；超敏酶标羊抗兔抗体来自于北京中杉生物公司（批号107257D9）；荧光羊抗兔抗体来自美国LI-COR公司（批号C51104-08）；RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司（批号AK1401）；SYBR Premix Ex TaqTMII购自 TaKaRa公司（批号 AKA1201）；PrimeScriptTMRT Master Mix购自TaKaRa公司（批号AK5101）。AP280-2包埋机、HM335E切片机来自德国MICROM公司；Nikon Eclipse 80i显微镜来自日本Nikon公司；Carl Zeiss Imaging系统软件来自德国Carl Zeiss公司；HVP-50高压灭菌器来自日本HIRAYAMA公司；吸入麻醉机来自深圳瑞沃德公司；DRP-9052电热恒温箱来自上海森信公司。

2 实验方法

2.1 动物分组、造模与给药 采用随机数字表法随机将48只SD大鼠分为损伤模型组、右归饮组和空白对照组，每组16只。按照Richelle Mychasiuk[3]提出的改良重物自由落体法进行造模：将损伤模型组与治疗组的大鼠置于吸入麻醉机中，吸入异氟烷（1%～2%in air/O2 mix）约 3min。当大鼠结膜反射消失、确认轻度麻醉后，将大鼠俯卧于锡箔纸平台上，下方放置海绵垫保护。另将一150g重量的砝码通过钓鱼线与铁架台拴住后，置于柱状聚乙烯管（直径2cm，长1.5m）中。将聚乙烯管置于大鼠头部上方，用插销固定砝码于大鼠头部中心上方0.5m处。撤去插销后，砝码自由落下，直接砸中麻醉下的大鼠头部正中处，大鼠便会跌落到海绵垫中，而砝码被钓鱼线系在海绵垫上方不继续下落，避免二次伤害。持续造模3天，每天1次。而空白对照组大鼠则不做任何处理。造模结束后对大鼠进行行为学分析，确定造模成功后，对大鼠进行给药，具体如下：根据成人日用临床剂量和前期研究结果，实验灌胃时将右归饮浓缩至最适浓度，对右归饮组大鼠以10g/kg体质量的剂量进行右归饮灌胃治疗，同时以等量的生理盐水对模型组和空白对照组大鼠进行灌胃，每天1次，共灌胃4周。

2.2 标本和检测指标 灌胃结束后，麻醉所有大鼠，取出大鼠的大脑组织，将每组8只大鼠的大脑进行石蜡包埋。再将每组剩余8只大鼠大脑的海马组织分离出，置于-80°C中保存。对石蜡包埋的标本进行HE染色和免疫组化检测，在光学显微镜下观察海马组织的病理变化和自噬指标mTOR:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Beclin-1基因编码蛋白（Beclin-1）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）的蛋白表达情况。冰冻海马组织蛋白则进行实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（QPCR）检测（TaKaRa公司RNA提取试剂说明书，提取大鼠海马组织后的总RNA进行逆转录，并测定mRNA的表达量），观察自噬指标mTOR、Beclin-1、LC3基因表达变化。引物序列见表1。

表1 Beclin-1、LC3、mTOR和 β-Actin引物

2.3 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件对数据进行统计分析，以均数标准差表示计量资料。对于属于正态分布的三组数据应用单因素方差分析比较，并进行两两比较的q检验，当P＜0.05时，差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 海马组织标本病理学观察 损伤模型组大鼠海马组织神经细胞数目稀少，排列紊乱，较多细胞核碎裂，细胞边缘较为模糊。右归饮组大鼠海马组织细胞数目较损伤模型组多，排列较均匀，细胞边缘欠清晰。空白对照组大鼠海马组织细胞排列均匀，边缘清晰，细胞核形态规则，胞外基质为粉红色，胞核为深蓝色（见插页图1）。

3.2 大鼠海马组织自噬蛋白表达变化 与空白对照组和损伤模型组比较，右归饮组大鼠自噬相关蛋白Beclin-1、LC3表达的阳性指数显著增高，mTOR表达则降低（P＜0.01，P＜0.05），空白对照组与损伤模型组之间的蛋白表达的阳性指数则无明显差异（P＞0.05）。见表 2，插页图 2-4。

表2 各组大鼠海马组织蛋白表达阳性指数比较

表2 各组大鼠海马组织蛋白表达阳性指数比较

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与损伤模型组比较，△P＜0.01；Beclin-1：BECN-1基因编码蛋白；LC3：微管相关蛋白 1轻链 3；mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

组别损伤模型组右归饮组空白对照组鼠数888 Beclin-1 0.05±0.05 0.11±0.04**△0.05±0.01 LC3 0.01±0.00 0.03±0.02**△0.01±0.01 mTOR 0.09±0.04 0.03±0.03*△0.08±0.04

3.3 QPCR检测大鼠海马组织自噬相关基因表达水平 与空白对照组和损伤模型组比较，右归饮组大鼠海马组织中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3表达含量显著增高（P＜0.01），mTOR 显著降低（P＜0.01），而空白对照组与损伤模型组之间的蛋白表达量则无明显差异（P＞0.05）。见表 3。

表3 各组大鼠海马组织自噬基因mRNA表达比较

表3 各组大鼠海马组织自噬基因mRNA表达比较

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与损伤模型组比较，△P＜0.01；Beclin-1：BECN-1基因编码蛋白；LC3：微管相关蛋白1轻链3；mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

组别损伤模型组右归饮组空白对照组鼠数888 Beclin-1 0.34±0.11 1.06±0.21**△0.43±0.36 LC3 1.12±0.09 1.75±0.21**△1.01±0.17 mTOR 1.74±0.73 0.91±0.17**△1.62±0.26

4 讨论

中医认为，肾主志，生髓通脑。脑为髓海，神经损伤后肾精不足，脑髓空虚，不能化生气血濡养肌肉骨骼，所以认知功能不足，小儿发育迟缓，运动不协调。研究发现，通过对肾虚模型大鼠温补肾阳，可以发现血浆和脑组织EPO表达含量增加，降低细胞的凋亡[2]。肾中精气可化髓充脑，故补肾益精健脑，用于治疗中枢神经损伤。右归饮作为补肾温阳的代表方，温补肾阳为主，而阴阳兼顾。研究发现右归饮可以保护肾虚模型大鼠损伤的神经细胞，升高大鼠大脑皮质抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白比率（Bcl-2/Bax），减少凋亡[2]；在脑脊髓炎轴突损伤的模型中，右归饮可以防止轴突的再次损伤，并且促进轴突的再生，增加神经生长因子的表达[4]。

自噬是真核细胞通过溶酶体机制降解自身成分的一种代谢途径，与细胞的存活、稳态、分化关系密切。自噬会清除某些毒素、病原体，还有变性的胞浆成分，中止细胞的进一步损伤。但自噬的作用具有两面性，过度激活自噬可导致细胞死亡，这取决于病变不同阶段的环境变化和治疗干预的不同[5]。近年来，自噬在阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统慢性退行性疾病中的研究较多[6-8]，但对大脑和脊髓等中枢神经损伤后自噬发生的研究较少，而且中枢神经损伤后的治疗基本上无实质性的突破。自噬主要的调节机制有磷酸肌醇三磷酸激酶（phosphatidylinositol kinase-3 kinase，PI3K）、mTOR 和氨基酸、激素等。mTOR途径是目前研究最多的信号途径的一种，与中枢神经系统的疾病关系密切[9-10]。mTOR是氨基酸和ATP的感受器，当AMP激活性蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）感受胞内ATP/AMP比值，进而通过mTOR信号启动自噬。Beclin-1及LC3则为自噬相关性蛋白，其表达量与自噬的水平呈正相关。

本研究结果显示，右归饮治疗后，免疫组化和QPCR的检测结果发现大鼠的海马组织Beclin-1、LC3的mRNA和蛋白表达量较损伤模型组和空白对照组显著上调（P<0.01），而mTOR的mRNA和蛋白表达量较其余两组则下调（P<0.01，P<0.05），说明右归饮通过下调mTOR，促进神经细胞自噬表达上调。同时，HE染色观察到右归饮治疗组的海马组织神经细胞数目较损伤模型组多，总体上排列较均匀，表明右归饮治疗后大脑神经细胞的破坏得到有效的缓解。