花生壳木犀草素蒸汽爆破预处理工艺优化及结构分析

赵鹏成 易军鹏 李 欣 杨亚皇 贺 健

(1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.河南科技大学化工与制药学院，河南 洛阳 471023)

花生(Arachishypogaea)亦名落花生，来源于豆科一年生草本油料植物，是人类重要的食用植物油资源[1]。中国是花生生产大国之一，2017年产量已达1 709.23万t，花生壳按30%计算，其产量约500万t[2-3]。花生壳黄酮组分的主要物质为木犀草素[4]，从黄酮类物质中分离得到的木犀草素在临床上具有止咳、祛痰及消炎的作用[5-6]，在体内具有抗菌、抗病毒、抗癌以及降低血脂等作用[7-10]。因此以木犀草素为代表的花生壳中黄酮类化合物也受到空前的重视。

目前，黄酮的提取方法主要有溶剂浸提法、超声辅助提取技术、微波辅助法和酶辅助提取法[11-14]。传统的提取方法存在得率较低的问题，微波辅助法和超声波辅助法能耗和成本较高，酶辅助提取法操作繁琐，不适于工业生产。蒸汽爆破(Steam Explosion Pre-treatment，SEP)常用于处理中草药和动物饲料等[15-16]。木质原料在高温、高压蒸汽作用下，纤维素聚合度下降，半纤维素部分降解，木质素软化，横向连结强度下降。当充满压力蒸汽的物料瞬时(0.087 5 s)泄压，孔隙中的水气剧烈膨胀，产生“爆破”效果，可部分剥离木质素，并将原料撕裂为细小纤维，原料中的细胞壁和表层纤维被不同程度的打破，使目标成分从细胞内部溶出进入提取介质中。研究[17-19]表明，蒸汽爆破技术可以使原料提取率明显提高，该预处理技术已广泛应用于油脂、粮食和中草药等行业。

本研究拟以花生壳为原料，以蒸汽爆破压力、维压时间、含水率等因素对木犀草素得率影响，通过响应面法优化蒸汽爆破预处理的最优工艺，并利用大孔吸附树脂对木犀草素粗品进行纯化，通过紫外分光光度法和红外图谱对纯化后的木犀草素进行定量定性分析，为今后对花生壳木犀草素的更深入研究以及花生壳资源综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

带壳花生：鲁花11号，产地河南洛阳；

大孔吸附树脂：AB-8型，东鸿化工有限公司；

木犀草素标品：96%，上海源叶生物科技有限公司；

无水乙醇、石油醚、盐酸、氢氧化钠、溴化钾等：分析纯，天津德恩化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

间歇式蒸汽爆破机：QBS-80型，鹤壁正道生物能源有限公司；

冷冻干燥机：SCIENTZ-10N型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

分析天平：FA-1005型，上海仪器有限公司；

PH计：PHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司；

旋转蒸发仪：RE-52A型，上海亚荣生化仪器厂；

电子扫描显微镜：JSM-5610LV型，日本电子株式会社；

紫外可分光光度计：UV-4800型，尤尼柯(上海)仪器有限公司；

气浴恒温振荡器：ZD-85型，常州金坛精达仪器制造有限公司；

傅里叶红外变换光谱仪：TENSPOR27型，德国BRUKER仪器公司；

高效液相色谱仪：E2695型，美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 花生壳蒸汽爆破预处理 将花生壳清洗干净，置于45 ℃烘箱内干燥24 h，将干燥的花生壳用等梯度比例的去离子浸泡12 h，放入QBS-80型蒸汽爆破机物料仓中，通入饱和蒸汽，选取不同梯度维压时间和蒸汽爆破压力，在微秒内(0.087 5 s)完成释压，预处理后的花生壳置于45 ℃干燥箱内干燥至恒重，装密封袋后避光保存。

1.3.2 蒸汽爆破预处理工艺优化

(1)单因素试验：根据文献[20]可知，蒸汽爆破预处理对活性物质提取的主要影响因素为爆破压强、维压时间和含水率。因此本试验对以上3个工艺参数分别设计5个梯度，通过控制变量法进行试验。即爆破压强因素选取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 MPa；维压时间因素选取15，30，45，60，75 s；含水率因素选取5%，10%，15%，20%，25%。固定参数为爆破压强1.2 MPa，含水率15%，维压时间45 s，比较不同爆破条件对木犀草素提取率的影响。

(2)响应面试验设计：通过单因素试验，确定预原料含水率、蒸汽爆破压力和维压时间3个独立变量，以木犀草素提取率为响应值，根据Box-Behnken试验的设计原理，对花生壳汽蒸汽爆破参数采用三因素三水平响应面分析法进行试验设计，建立数学模型，并对各因素间的相互作用，以及各因素与响应值之间的关系进行分析。单次试验重复3次，试验结果取平均值。

1.3.3 木犀草素标准曲线的绘制 精密称取木犀草素标准品5 mg，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，吸取木犀草素标准溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL分别加70%乙醇定容至10 mL，混匀，利用紫外分光光度计测定352 nm处吸光度[21-23]。以吸光度值为纵坐标，木犀草素质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.165 8x+0.018 6(R2=0.999 8)。

1.3.4 花生壳木犀草素提取工艺 将未处理及蒸汽爆破预处理后的花生壳粉碎过60目筛。称量花生壳粉末3 g，加入10倍体积的石油醚萃取脱脂3次。向脱脂后的花生壳粉末按1∶15(g/mL)加入70%乙醇，70 ℃回流提取1 h，抽滤得滤液[24]。残渣按上述方法重复提取1次，合并两次滤液作为提取液，取1/5提取液用70%乙醇稀释30倍并测定其吸光度，结合木犀草素标准曲线，按式(1)进行木犀草素提取率测定。

(1)

式中：

S——木犀草素提取率，%；

c——木犀草素提取液浓度，mg/mL；

v——提取液体积，mL；

D——稀释倍数；

m——花生壳粉末样品质量，g。

1.3.5 木犀草素的纯化 按1.3.3制备木犀草素提取液，置于50 ℃真空旋转蒸发仪中，旋蒸至水浸膏，加入10倍量的去离子水进行洗涤，8 000 r/min离心取沉淀，并重复洗涤沉淀两次。加入无水乙醇溶解沉淀物，离心取上清液，旋蒸至近干，加入70%乙醇30 mL进行洗涤，重复洗涤两次，合并两次洗涤液调整成pH为6的静态吸附样品液待用。

AB-8大孔吸附树脂经无水乙醇、酸、碱预处理后，洗涤至中性[23]。称取预处理好的AB-8湿树脂20 g，装入100 mL具塞锥形瓶中，加入60 mL样品液，密封后放入摇床中25 ℃，150 r/min振摇6 h，取出静置24 h，过滤取充分吸附后的树脂进行动态解吸。将吸附后的树脂进行湿法装柱，用70%乙醇进行动态洗脱，流速2.0 BV/h，洗脱液总量200 mL。利用紫外分光光度计对洗脱液进行木犀草素含量测定。取1/2洗脱液置于50 ℃真空旋转蒸发仪中，旋蒸至水浸膏，去离子水洗出并定容至20 mL，真空冷冻干燥成粉末，得木犀草素纯化样品，准确称量样品重量并计算木犀草素纯度。剩余1/2洗脱液进行高效液相色谱定性分析。

1.3.6 花生壳微观结构观察 将干燥至恒重的花生壳样品用导电胶带粘到样品台上，用扫描电子显微镜分别观察不同汽爆参数预处理和未经汽爆预处理的花生壳微观结构的变化。

1.3.7 木犀草素红外光谱分析 对木犀草素标准品、未处理的木犀草素样品和汽爆处理的木犀草素样品采用溴化钾压片法制样。将溴化钾粉末在红外干燥箱内干燥，取2 mg木犀草素样品与40 mg左右的溴化钾粉末在研钵中充分研磨，使用压片机制成薄片后在4 000～400 cm-1波长范围内进行红外光谱扫描，用不加样品的溴化钾薄片进行背景扫描。

1.3.8 花生壳木犀草素高效液相色谱分析 同时对纯化后样品进行高效液相检测，色谱条件为：Diamonsil-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，甲醇-0.5%磷酸(70∶30，体积比)作为流动相，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL，检测波长352 nm。

1.4 数据分析

以上所有试验重复3次，采用DPS 9.50数据处理软件，对试验结果进行单因素试验统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 物料含水率对花生壳木犀草素得率的影响 由图1 可知，控制维压时间及蒸汽爆破压强相同的条件下，木犀草素得率随物料含水率提高先增加后降低，在含水率为15%条件下木犀草素得率达到最高。由于适当的水分能够使物料充分溶胀，提高蒸汽渗透效率，进而增强蒸汽爆破效果，提高木犀草素得率。当物料水分过饱和，多余的水分占据物料内部间隙，阻碍蒸汽渗透，降低蒸汽爆破效果[25]。

2.1.2 爆破压强及维压时间对花生壳木犀草素得率的影响 由图2、3可知，随着蒸汽爆破压力的升高和维压时间的延长，花生壳木犀草素得率均呈先增加后减少趋势，在蒸汽爆破压强1.2 MPa及维压时间45 s条件下木犀草素得率达到最高。这是由于黄酮成分大部分被包裹在细胞壁中[26]，随着爆破强度的增强，有效地打破花生壳内部细胞壁的阻碍作用，促进其中的黄酮类物质提取率增加[27]。但当爆破压力和维压时间继续增大和延长时，木犀草素提取率反而出现降低，与张琪等[28]蒸汽爆破预处理对粉葛总黄酮及抗氧化性的影响结果一致。由于在高温高压条件下可能会促使花生壳中活性成分发生化学变化，导致黄酮类物质发生降解，另外细胞内部溶出的黄酮类物质又重新聚合形成不溶性物质[29]，最终致使木犀草素提取率随压强和时间的变化先增后减。因此适当的爆破压力和维压时间可以对木犀草素得率起到促进作用。

图1 含水率对木犀草素得率的影响
Figure 1 Effect of water content on the extraction yields of luteolin from peanut shell

图2 爆破压强对木犀草素得率的影响Figure 2 Effect of steam explosion pressure on the extraction yields of luteolin from peanut shell

图3 维压时间对木犀草素得率的影响Figure 3 Effects of residence time on the extraction yields of luteolin from peanut shell

2.2 响应面结果分析

2.2.1 试验设计与结果分析 根据Box-Behnken试验设计原理，通过响应面分析法对花生壳蒸汽爆破技术的提取工艺进行优化。试验因素和水平见表1，响应面设计方案及结果见表2。

采用Design Expert分析软件进行回归拟合分析，分析得到多元二次回归模型方程：

(2)

表1 Box-Behnken试验因素和水平表Table 1 Coded levels of independent variables used in Box-Behnken design

表2 响应面设计方案及结果Table 2 Box-Behnken design with independent variables and response values

表3 回归模型方差分析及显著性检验Table 3 Analysis of variance (ANOVA)for the regression model

2.2.2 试验因素间的相互作用 为更直观说明交互影响作用，对交互项作响应面图和等高线图。其中含水率和蒸汽爆破压力的交互项呈现出典型的椭圆形(见图4)，说明两因素交互作用显著。

图4 含水率和爆破压强对花生壳木犀草素得率的交互影响Figure 4 Interaction effects of water content and blasting pressure on yield of luteolin from peanut shell

2.2.3 最佳工艺参数优化 根据DPS 9.50软件预测，得到蒸汽爆破工艺的最佳参数组合为蒸汽爆破压力1.24 MPa，维压时间 46.27 s，预浸泡含水率15.89%，在相同提取条件下，木犀草素得率为0.928%。考虑到现实操作性，蒸汽爆破工艺参数校正为蒸汽爆破压力1.25 MPa，维压时间46 s，预浸泡含水率16%，在此条件下木犀草素得率为0.926%，实际提取率与理论值接近，差异不显著。未经爆破处理的花生壳在相同提取条件下木犀草素得率仅为0.472%。本试验经过蒸汽爆破处理后的样品，在相同提取条件下最终提取量高出未经爆破处理的样品近1倍。说明该模型的拟合程度较好，校正后的蒸汽爆破参数准确可靠，具有一定实用价值。

2.3 蒸汽爆破对花生壳的微观结构影响

图5对比了未经汽爆处理和在蒸汽爆破压力1.25 MPa，维压时间46 s，预浸泡含水率16%的条件下处理的花生壳的扫描电镜图。未经汽爆处理的花生壳虽然表面也有许多沟堑和坑壑，未经处理的花生壳表面是由长纤维形成的规则的网状结构，并覆盖着均一光滑的片状结构。而经汽爆处理后，蒸汽爆破花生壳的表皮层受到破坏，出现了很大程度的断裂及较深的孔洞，网状纤维消失，取而代之的是熔融态的片层状结构。片层表面的细长丝状突起可能是由于汽爆造成花生壳木质素和半纤维素的降解，从而使纤维素析出并附着在物料表面，呈细丝状。花生壳的熔融变化也说明了在汽爆中发生了一些化学变化，可能是木犀草素提取率提高的原因。

图5 未处理和蒸汽爆破处理花生壳的扫描电镜图Figure 5 Scanning electron micrographs of untreated peanut shell and steam-exploded peanut shell (×1 000)

2.4 红外光谱分析

A.木犀草素标品 B.爆破处理纯化后样品 C.未爆破处理纯化后样品
图6 木犀草素标品及纯化后样品红外图谱
Figure 6 FT-IR spectra of Luteolin standard and purified samples

2.4 高效液相色谱分析

木犀草素标品的出峰时间为4.7 min，两个提取纯化样品中均含有木犀草素。由图7可知，本研究提取纯化得到的木犀草素仍含有部分杂质，与红外光谱分析一致。经爆破处理后，纯化样品中的木犀草素含量显著增加，与紫外分光光度法检测的结果一致，测得木犀草素含量在纯化后冻干品中达到32.81%。说明蒸汽爆破预处理，可以显著提高木犀草素的提取率。

A.木犀草素标品 B.爆破处理纯化后样品 C.未爆破处理纯化后样品
图7 木犀草素标准品、未爆破处理纯化后样品和爆破处理纯化后样品HPLC图
Figure 7 Luteolin standard,unexploded purified sample and exploded purified sample HPLC diagram

3 结论

将花生壳进行蒸汽爆破预处理，花生壳木犀草素得率显著提高。经响应面分析以及回归模型预测，蒸汽爆破预处理的最佳条件为蒸汽爆破压强1.25 MPa，维压时间46.0 s，含水率16%。在该条件下，木犀草素提取率为0.926%，约为未处理的2倍。蒸汽爆破预处理后的花生壳木质素、纤维素发生断裂和降解，表面结构变得松弛有空隙，溶剂渗透加快，促使木犀草素提取率增加。通过分析红外光谱图和HPLC图谱得出，蒸汽爆破纯化后样品中主要物质为木犀草素，其含量在纯化后冻干品中达到32.81%，远高于未蒸汽爆破处理样品。因此，蒸汽爆破预处理能够明显增加花生壳提取物中木犀草素的提取率。本研究发现蒸汽爆破技术使花生壳中木犀草素的结构发生了一定程度的改变，但具体改变的方向和影响值得进一步探讨。