2型糖尿病合并骨质疏松患者外周血中VDR mRNA表达与25(OH)D、甘油三酯的关系研究

张旋 罗丽娅 王信 肖雪 王勇朋 阳琰 王哲 朱玉玉 樊思桐 李琪

1．遵义医科大学附属医院内分泌科，贵州遵义563099

2．遵义医科大学附属医院骨科，贵州遵义563099

3．遵义医科大学附属医院全科医学科，贵州遵义563099

4．遵义医科大学附属医院影像科，贵州 遵义563099

近年来大量的流行病学和临床研究发现，25(OH)D与糖尿病及其并发症等有关［1-3］。研究发现，25(OH)D具有保护胰岛β细胞功能［4］、调节炎症和免疫反应，改善骨代谢等作用［5］，且短期补充25(OH)D能改善胰岛 β细胞功能［6］。骨质疏松(osteoporosis，OP)是以骨量减少，骨质量受损及骨强度降低，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病。根据《骨质疏松症防治中国白皮书》，我国至少有6 944万人患有OP，2.1亿人存在低骨量［7］。OP已成为我国第4位常见慢性疾病，T2DM人群中OP的发病率也明显高于正常对照组［8］。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)、OP 这两种疾病均已成为世界上非常普遍的全身代谢性疾病，两者往往好发于同一个体，并且两者发病均与维生素D缺乏、脂代谢紊乱有关。25(OH)D缺乏不仅导致糖、脂代谢紊乱，还可以影响骨转换、抑制骨吸收，最终导致 OP［9－10］。目前对于维生素 D 受体(vitamin D receptor，VDR)与糖尿病之间的关系研究较多，但是关于T2DM合并OP患者血浆中VDR mRNA表达与 25(OH)D、甘油三酯(triglyceride，TG)的关系如何，目前国内外未见相关研究报道。因此，本研究从分子水平检测外周血中VDR mRNA表达在T2DM合并骨质疏松、单纯T2DM及正常对照人群的差异性，探讨外周血中VDR mRNA表达与25(OH)D、TG的关系，可能为T2DM、OP的防治提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年6月至2017年5月就诊于遵义医科大学附属医院内分泌科门诊及住院治疗的初诊T2DM患者100例，据骨密度测定结果分为单纯T2DM组 48例［年龄(59.4±7.3)岁，男25例，女23例］、T2DM+OP组 52例［年龄(59.9±7.6)岁，男27例，女25例］;遵义医科大学体检中心年龄及性别相匹配的健康者90名［年龄(58.9±8.5)岁，男45例，女45例］作为对照组(NC组)。糖尿病诊断标准符合1999年WHO糖尿病诊断标准。该研究已经获得医院伦理委员会批准及患者知情同意。

纳入标准:①绝经1年以上的女性及年龄≥60岁的男性;②18 kg/m2≤体质量指数(body mass index，BMI)≤25 kg/m2;③未接受过任何糖尿病治疗措施，包括饮食、运动疗法;④肝肾功能正常，无其他严重器质性疾病及糖尿病急、慢性并发症;⑤正常对照组无糖尿病及痛风家族史;⑥无吸烟史及长期大量饮酒史。

排除标准:①1型糖尿病或其他特殊类型糖尿病;②有高血压病史、心脑血管疾病病史、骨折史、急慢性感染、恶性肿瘤病史，合并甲状腺功能亢进、甲状腺功能低下、甲状旁腺疾病、代谢性骨病等内分泌疾病;③妊娠或哺乳期妇女或长期服用避孕药的妇女;④近1个月内使用过影响糖、脂代谢及其他影响体内25(OH)D代谢的药物。

1.2 研究方法

1.2.1 血浆25(OH)D及生化指标的检测:研究对象试验前禁食12 h，禁饮8 h，空腹抽静脉血，测血脂、血糖、胰岛素。用电化学发光法测25(OH)D(试剂盒购于Roche Diagnostics GmbH)，试剂盒灵敏度为0.83 ng/mL，测量范围为0.83～322.5 ng/mL，批内差异为(7.6±3.5)%，批间差异为(6.7±2.0)%。FINS采用电化学发光法测定含量(试剂盒购于Roche Diagnostics GmbH)，血脂包括 TG、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)采用全自动生化仪统一检测，FBG采用己糖激酶法，HbA1c水平采用高压液相法测定。Real Time-PCR检测VDR mRNA的表达。测血压、身高、体重并计算BMI(kg/m2)，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=空腹血糖(FPG)×空腹胰岛素(FINS)/22.5。

1.2.2 RNA的提取和DNA的合成:所有研究对象采集5 mL外周静脉血，枸橼酸钠抗凝。采用淋巴细胞分离液从外周血中分离淋巴细胞，然后用Trizol法提取总RNA。紫外分光光度计检测RNA在260 nm/280 nm波长处的吸光度值，A260/A280在1.9～2.1纯度符合要求。总mRNA提取试剂盒及第一条链合成试剂盒由Promega公司提供;Real time PCR荧光定量试剂盒由Promega公司提供。根据试剂盒说明进行操作。

1.2.3 Real time PCR荧光定量反应体系及过程:提取血浆中总RNA，以总RNA 1.5μg为逆转录反应模板，进行逆转录总的反应体积是20 μL。VDR引物正义:5’CAGGCTATCATTACGGAGTC 3’;反义:5’CTGGCATTTGTTTCTGTTCT 3’;β-acti引物正义:5’TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG 3’;反义:5’TGCTGTCACCTTCACCGTTC 3’。反应条件:94℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃～72℃退火30 s，75℃延伸1 min，循环28～31次，72℃终末延伸5 min。退火温度和循环次数VDR 56℃，30个循环;β-actin 57℃，28个循环。为了校正误差，本研究利用管家基因β-actin作为内参，以待测样品目的基因的拷贝数平均值除以该样品内参基因的拷贝数平均值，得到目的基因的相对含量。样品中模板的拷贝数可由SDS软件通过所得到的Ct值从标准曲线上计算得到。

1.2.4 设计合成引物:通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)的Gene数据库，查找人各目的基因的mRNA核苷酸序列及序列号，然后用Primer-BLAST比对引物特异性，由TaKaRa公司合成。各引物的序列见表1。

表1 各基因引物序列(荧光定量PCR测定)Table 1 Specific primers used for Real-time PCR

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(珋x±s)表示，计量资料为正态分布采用两组独立样本t检验，非正态分布则采用非参数秩和检验，计数资料则用卡方检验。采用Pearson相关分析VDR mRNA表达与25(OH)D、血糖等指标的关系，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般资料及临床生化指标的比较

单纯T2DM组与NC组相比，血浆25(OH)D水平减低，而 TG、FPG、2h PG、HbA1c、FINS、HOMA-IR水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05);T2DM+OP组与NC组相比，血浆25(OH)D水平减低，而TG、FPG、2h PG、HbA1c、FINS、HOMA-IR 水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05);T2DM+OP组与单纯T2DM组相比，血浆中25(OH)D水平减低，而TG水平升高，差异有统计学意义(t=24.232，P＜0.05)，FPG、2h PG、HbA1c、TC、FINS、HOMA-IR 差异无统计学意义(P＞0.05);三组间年龄、血压、TC、HDL-C、LDL-C相互比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表2。

表2 各组一般资料及临床生化指标比较(珋x±s)Table 2Comparison of general characteristics and biochemical indicators among the groups(珋x±s)

续表2各组一般资料及临床生化指标比较(珋x±s)Continued table 2Comparison of general characteristics and biochemical indicators among the groups(珋x±s)

2.2 Real time PCR检测VDR mRNA的表达

单纯T2DM组与NC组相比，外周血中VDR mRNA表达水平减低(1.07±0.23 vs 2.98±0.21)，差异有统计学意义(t=21.256，P＜0.05);T2DM+OP组与NC组相比，外周血中VDR mRNA表达水平减低(0.35±0.12 vs 2.98±0.21)，差异有统计学意义(t=23.522，P＜0.05);T2DM+OP组与单纯 T2DM组相比，外周血中 VDR mRNA表达水平减低(0.35±0.12 vs 1.07±0.23)，差异有统计学意义(t=24.232，P＜0.05)(图1)。

图1 三组受试者血清25(OH)D水平的比较Fig．1 Comparison of serum 25(OH)D levels between three groups of subjects

2.3 Pearson相关分析结果

血浆25(OH)D 与性别、年龄、血压、BMI、TC、HDL-C、LDL-C的相关性无统计学意义(P＞0.05);与 HbAlc、HOMA-IR、FINS、FPG、2h PG、TG 呈负相关(相关系数 r分别为－0.342、－0.353、－0.361、－0.546、－0.426、－0.342，P＜0.05);与 VDR mRNA表达呈正相关(r=0.717，P＜0.05)。详见表3。

表3 血浆中25(OH)D水平与临床生化指标的相关性分析Table 3 Correlation analysis of plasma 25(OH)D levels and clinical biochemical indicators

3 讨论

维生素D的生物学作用已经超出传统范畴，与心血管疾病、代谢综合征、肿瘤和免疫应答等均有关［11－12］。维生素D与糖尿病的关系已成为研究热点，维生素D缺乏者不仅与骨质疏松有关，更易患代谢综合征及糖尿病［13］，糖尿病患者中普遍存在维生素D水平的缺乏［14］。血清中25(OH)D与脂肪组织维生素D受体基因表达有关，并且与糖代谢有关［15］。T2DM、脂代谢紊乱及 OP，它们看似独立的疾病，但它们三者往往并存于同一个体，使患者生活质量更趋下降，加重了家庭及社会的经济负担，已成为全球共同关注的健康问题。长期以来，研究T2DM发病机制时首先考虑的是血糖和胰腺，但迄今为止，T2DM发病机制研究一直未取得突破性进展。最新研究发现，血清中维生素D缺乏不仅导致OP，还可能导致糖、脂代谢紊乱，它们三者之间关系紧密，但它们之间具体的关联机制如何，尚未阐明。目前国内外未见2型糖尿病合并骨质疏松患者血浆中VDR mRNA表达与25(OH)D、甘油三酯关系方面的相关研究报道。因此，从维生素D入手对这一问题进行探索，不仅对阐明T2DM发病机制具有重要作用，还可能对临床早期联合防治糖尿病、脂代谢紊乱及OP具有深远的意义。

本研究结果示，T2DM+OP组与单纯T2DM组相比，血浆中25(OH)D水平减低，而TG水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05);单纯T2DM组与NC组相比，血浆中VDR mRNA表达水平减低，差异有统计学意义(P＜0.05);T2DM+OP组与NC组相比，血浆中VDR mRNA表达水平减低，差异有统计学意义(P＜0.05);T2DM+OP组与单纯T2DM组相比，血浆中VDR mRNA表达水平减低，差异有统计学意义(P＜0.05)。导致 T2DM合并 OP人群外周血中VDR mRNA表达水平较单纯T2DM及正常人群减低的原因与T2DM合并OP人群血浆25(OH)D水平更低有关，推测T2DM合并OP更容易患维生素D缺乏及脂代谢紊乱，维生素D缺乏及脂代谢紊乱可能通过下调外周血中VDR mRNA表达而导致糖尿病及OP的发生发展。

本研究结果还显示，血浆中25(OH)D水平与HOMA-IR、TG呈负相关，25(OH)D缺乏可能通过降低机体对胰岛素的敏感性，加重胰岛素抵抗，导致脂代谢紊乱，引起甘油三酯水平升高。研究发现，维生素D有降脂作用，且25(OH)D与TG、LDL、TC之间存在线性负相关［16］。维生素D的生物效应是由维生素D受体介导的［17］，维生素D可以通过调节胰岛β细胞内的VDR以及胰腺组织中维生素D依赖性钙结合蛋白促进β细胞合成和分泌胰岛素，减轻IR［18］。提示VDR及25(OH)D参与了糖尿病、OP的发生发展，维生素D缺乏影响糖尿病、OP发病的可能机制是:体内维生素D减低，使外周血中VDR mRNA表达减少，维生素复合物形成减少，减少维生素D的生物学效应，从而引起脂代谢及骨代谢紊乱，形成高甘油三酯血症、骨量减少，加重胰岛素抵抗，促使糖尿病、OP发病率增高;反过来，糖尿病合并OP后血浆中25(OH)D水平减低，加重高甘油三酯血症、骨量丢失及胰岛素抵抗，这就形成了一个恶性循环。因此，积极补充维生素D可能会打破这一恶性循环，降低TG水平，减少骨量丢失，从而改善IR及骨代谢，可能对T2DM、OP的联合防治具有非常重要的作用，但其具体机制有待进一步研究探索。