奶粉中维生素B2标准物质的研制

引言

维生素B2，是人体必需的营养元素[1]，是婴幼儿等配方奶粉的重要添加物。为了保障科学定量摄入，准确定量检测奶粉中维生素B2对监管奶粉营养成分及安全具有重要意义[2]。研制奶粉中维生素B2标准物质，不仅可保证检测结果的准确性，还能为食品、营养学的分析检测和研究提供量值溯源保障[3]。本文按照ISO导则35[4]，对标准物质进行均匀性检验、稳定性考察、定值分析和不确定度评价。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪，美国Agilent；高压灭菌锅；恒温水浴锅；HCl、NaOH、三水乙酸钠、冰乙酸，优级纯；甲醇，色谱纯；木瓜蛋白酶；高峰淀粉酶；维生素B2（C17H20N4O6） 标 准 品，CAS号：83-88-5， 纯 度≥98%。

1.2 定值方法

取2.0 g样品于具塞比色管中，加入60 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，摇匀，放入高压灭菌锅，121℃下保持30min，冷却。用1 mol/LNaOH调pH至6.0～6.5，加2 mL混合酶（称2.345g木瓜蛋白酶和1.175g高峰淀粉酶，加水溶解定容至50 mL），摇匀，置37℃恒温水浴锅过夜。酶解液加水定容至100 mL，滤纸过滤，取滤液过0.45 μm滤膜待测。

HPLC条 件： C18色 谱 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙酸钠溶液（0.05 mol/L），甲醇溶液（65：35）；流速，1 mL/min；柱温：30℃；激发波长462 nm，发射波长522 nm。

1.3 标准物质制备

经筛查，选取一款市售奶粉，将奶粉均匀化并分装为30克/瓶的包装，置于棕色广口瓶中，密封，低温保存。

1.4 标准物质定值

国内10家权威实验室采用HPLC法联合定值，向各机构随机发送2个包装样品，每个包装取3个子样，测定平均值作为检测结果。按ISO Guide 35(2006)，对定值结果统计分析。

1.5 均匀性检验

随机抽取15个包装，进行瓶间均匀性检验；每个包装取2个子样，进行瓶内均匀性检验。用方差分析法判别标准物质均匀性。

1.6 稳定性考察

按照先密后疏的原则，在一定时间间隔内选择定值方法检测在规定条件下保存的标准物质量值随时间的变化情况。用t检验法判别标准物质均匀性。

长期稳定性：标准物质置于-20℃储存，分别在第1、2、3、5、7个月进行稳定性监测。每次取5个包装，每个包装取一个子样，测3次，计算平均值，5个包装测定结果平均值作为检测结果。

短期稳定性：各随机抽取5个包装分别置于60℃烘箱（模拟运输最高温度）和-30℃冷冻箱（模拟运输最低温度），分别在第1、7、13、19天取出进行稳定性监测。检测方法与长期稳定性检测相同。

1.7 不确定度评价

1.7.1 均匀性与稳定性相对不确定度

用均匀性、稳定性试验的数据，分别计算均匀性、长期和短期稳定性引入的不确定度ubb、urel(lts)、urel(sts)。

1.7.2 定值过程引入的不确定度

由维生素B2标准品的相对不确定度urel(c)和联合定值的相对不确定度u0rel(char)引入。

标准品的相对不确定度来源有：标准品质量引入的不确定度urel(m)；线性拟合引入的不确定度u1rel(C0)；标准品的不确定度u2rel(C0)；稀释引起的不确定度urel(V0)。

1.7.3 扩展不确定

扩展不确定度通过均匀性、稳定性和合成定值过程对特性值总不确定度的贡献来估算的。

式中，k=2，m为定值的总体平均值。

2 结果与分析

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2.1 定值结果

10家实验室联合定值结果和定值引入的相对不确定度见表1。统计分析，数据全部服从正态分布，格拉布斯法检验未发现异常值且无显著性差异，柯克伦法等精度检验数据是等精度的，即定值结果的总体平均值为标准物质的定值结果。

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2.2 均匀性检验

均匀性检验结果及其引入的不确定度ubb的结果见表2。F值＜F0.01(14，15)=3.75，表明在0.01显著性水平标准物质中维生素B2含量是均匀的。

2.3 稳定性考察

标准物质长期、短期稳定性考察结果及其引入的不确定度结果见表3和4。结果t值均小于临界值t(0.05，4)=2.776，认为标准物质是稳定可靠的。

2.4 不确定度评价

2.4.1 定值过程引入的不确定度

标准物质定值过程引入的不确定度结果见表5。

2.4.2 扩展不确定度

按式（3）计算标准物质的扩展不确定度为UCRM=2.445，本文研制的奶粉中维生素B2标准物质定值结果为15.7±2.4 mg/kg（k=2）。

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3 结论

本文研制的奶粉中维生素B2标准物质，定值结果准确可靠，并进行了均匀性检验、稳定性考察和不确定度评价，确保在不同时间、使用不同包装的该种标准物质，所使用的量值及不确定度是准确可靠的。