鲫CyHV-2病毒病的诊断及组织病理损伤研究

熊关庆，段 靖，冯 杨，倪 萍，黄小丽*，汪开毓，邓永强，耿 毅，陈德芳，欧阳萍，杨世勇

（1.四川农业大学动物科技学院，成都 611130；2.四川农业大学动物医学院，成都 611130；3.四川省农业厅，成都 610016）

鲤疱疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2），也称为金鱼（Carassius auratus）造血器官坏死病病毒（goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）[1]。CyHV-2 具有极强的宿主特异性，只感染金鱼、鲫鱼及其普通变种[2]。1995年Stephens[3]首次在日本金鱼体内发现CyHV-2。接着在美国[4]、中国台湾[5]、英国[6]等国家和地区也相继发现金鱼感染该病毒，并可造成严重的经济损失。随着时间的推移，该病毒的感染范围不断扩大。2011年，匈牙利的A.Doszpoly[7]首次在养殖的鲫鱼体内检测到CyHV-2。随后，捷克[8]、意大利相继也有了关于CyHV-2 感染鲫鱼的报道。直到2012年，Wang L.等[9]才首次在我国东部地区养殖的鲫鱼体内发现CyHV-2。

鲫（Carassius auratus）是我国重要的淡水养殖品种之一，具有食性杂、适应能力强、肉质鲜美和营养丰富等优点[10]。近年来，我国鲫鱼的养殖规模越来越大，2013年中国鲫鱼的年产量达到259.44 万t[11]，在水产养殖中占有举足轻重的地位。由于养殖密度不断增大、种质退化以及管理不善等多方面因素的影响，我国鲫鱼养殖业受到疾病的威胁和挑战越来越大。其中，鳃出血症是近年来危害鲫鱼健康养殖的主要疾病，给鲫鱼养殖造成了极大的经济损失。鳃出血症成为了阻碍鲫鱼健康养殖的巨大瓶颈，鲫鱼鳃出血症的正确诊断与防治对于鲫鱼养殖具有重要意义。

2016年5月，四川某鲫鱼养殖场的鲫鱼出现以烂鳃、鳃出血及鳃发黑为主要症状，并伴有鱼鳍末端发白、鳃盖出血的大规模死亡现象，死亡率极大，给养殖户造成了巨大的经济损失。本研究通过剖检观察、寄生虫学检测、细菌学检测、病毒学检测等方法，对发病鲫鱼进行诊断，结合组织病理技术检测组织病理损伤程度，拟探寻该病的主要损伤靶器官并分析致病原因，为相关疾病的诊断提供参考借鉴。

1 材料和方法

1.1 试验动物

具有典型患病症状的鲫鱼5 尾，来自四川某鲫鱼养殖场，体长15～18 cm，用于剖检观察和病料采集。送检时病鱼存活。

1.2 剖检观察

将患病鲫鱼用MS222 麻醉后剖检。首先检查病鱼体表完整性及其他体表症状，同时取少量鳃丝和体表黏液压片，显微镜下观察有无寄生虫感染。打开围心腔、腹腔依次观察各内脏器官大体病变情况。

1.3 细菌学检测

无菌操作条件下从患病鱼的肝脏、脾脏中取样于LB 培养基上划线接种，22 ℃恒温培养，48 h 后观察细菌生长状况。

1.4 病毒学检测

参照T.B.Waltzek 等[12]设计引物对患病鱼组织进行CyHV-2 PCR 检测（表1）。取患病鱼肝胰脏、脾脏、肾脏和鳃等组织，根据TRIzol 试剂盒说明书快速提取DNA，接着进行PCR 扩增。PCR 扩增体系为：12.5 μL Mix-reaction buffer，上、下游引物各 1 μL，加入 cDNA 模板 2 μL，8.5 μL ddH2O。PCR 扩增条件：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 1 min，53 ℃复性30 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环，72 ℃延伸 10 min。反应结束后取10 μL 扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下分析结果。PCR 产物经DNA 纯化试剂盒纯化后，送成都擎科生物技术有限公司进行序列测定。将测序结果在GenBank 上进行BLAST 比对。

表1 CyHV-2 扩增引物Table 1 CyHV-2 amplification primers

1.5 系统发育树构建

将测序结果通过NCBI 的BLAST 查找同源性序列，利用DNAMAN 进行序列编辑和比对分析，MEGA7.0 邻近法构建系统进化树进行分析。

1.6 组织病理损伤观察

分别取患病鲫的鳃、肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肠、脑等组织器官，用10%的中性缓冲福尔马林固定液固定，水洗过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片，苏木精-伊红（H.E）染色，中性树脂胶封片，光学显微镜下观察组织病理损伤，并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 尸检与大体病理学观察

患病鲫鱼主要表现为尾鳍末端发白；鳃丝末端轻微腐烂，鳃丝颜色加深，出血样表现。打开腹腔后，可见少量带血腹水流出（图1）。寄生虫检查结果表明，鳃丝和体表黏液未见明显的寄生虫寄生。

2.2 细菌学检测

无菌条件下，从患病鱼的肝脏、脾脏接种细菌至LB 培养基，连续观察一周，未观察到细菌生长。

图1 患病鲫鱼临床特征Figure 1 Clinical characteristics of diseased crucian carp

2.3 PCR检测结果

提取患病鲫鱼的组织的DNA，进行PCR 扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测结果显示（图2），位于约370 bp 处均可见特异性DNA 扩增条带，与CyHV-2 预期大小相符，阴性对照泳道无明显条带。将测序结果在GenBank 上进行BLAST 比对，该序列与GenBank 中CyHV-2 基因有高度同源性，PCR检测结果显示患病鲫鱼为CyHV-2 阳性。

图2 PCR 检测结果Figure 2 PCR test results

2.4 系统发育树构建

将测序结果上传到NCBI-GenBank 获得基因登录号：NBK53701，通过MEGA 7.0 软件利用邻接法构建系统进化树（图3），结果显示，FJY 株与CyHV-2聚为一支。同源性分析表明，本试验所分离的病毒与CyHV-2 亚洲株有相对较高的核酸同源性，同源性达到80%。

图3 基于FJY 利用邻近法构建CyHV-2 进化树Figure 3 CyHV-2 phylogenetic tree constructed by proximity method based on FJY

2.5 病理组织学观察

经石蜡切片，H.E 染色后观察发现，该病靶器官主要为脾脏、鳃、肠道、肾脏、心脏和肝脏，所有鱼均表现为重度坏死性脾炎、重度出血性坏死性鳃炎、重度坏死性肠炎、中度至重度坏死性肾炎、中度坏死性心肌炎和心内膜炎、轻度至中度脂肪肝和轻度坏死性肝胰腺炎，其余组织未发现明显病变。

脾脏：表现为重度坏死性脾炎。低倍下可观察到脾脏严重的充血，淋巴细胞减少（图4A）；脾实质中可见桥状相连的坏死灶，伴有有大量的炎性细胞浸润（图4B）；脾血管系统受损严重，椭圆体壁及血窦内皮细胞严重坏死、淡染、空泡化，可见部分细胞缩小，染色质固缩、崩解成大小不等的团块（图4C）。

鳃：鳃表现为重度出血性坏死性鳃炎。低倍下可观察到大面积鳃丝出血（图4D）；高倍下可见鳃小片坏死、脱落中（图4E）；鳃丝间有脱落堆积的红细胞和炎性细胞（图4F）。

肠道：肠道表现为重度坏死性肠炎。肠道黏膜下层和固有层内可见大量炎性细胞浸润（图4G）；黏膜下层及固有层内毛细血管充血，大量红细胞充盈（图4H）；严重的可见肠绒毛顶端上皮细胞大量坏死脱落，固有层明显裸露，内可见严重充血的毛细血管（图4I）。

肾脏：肾脏表现为中度至重度坏死性肾炎。肾小管上皮细胞缩小，胞浆浓缩、红染，上皮细胞脱落，与基膜分离，部分消失（图4J）；肾间质排列紊乱，细胞稀疏，间质内毛细血管内皮细胞造血母细胞染色质浓缩、坏死、崩解成大小不等的团块（图4K）。肾球囊扩张，可见肾小球内毛细血管内皮细胞坏死，细胞核浓缩、崩解（图4L）。

心脏：心脏表现为中度坏死性心肌炎和中度心内膜炎。心内膜内皮细胞坏死，细胞体积缩小，染色质浓缩、消失，心肌纤维横纹消失，染色不均（图4M）；部分心肌细胞核大量减少，呈指环样变，偶尔可见心肌纤维内白细胞浸润，心肌纤维胞浆消失，将白细胞包裹在内，部分区域心肌纤维呈小灶样坏死，纤维溶解消失，被大量炎性细胞浸润取代（图4N）。

头肾：头肾为轻度炎症。低倍下可观察到头肾轻微的充血和少量的炎性细胞（图4O）。

肝胰脏：肝脏表现为轻度至中度脂肪肝和轻度坏死性肝胰腺炎。肝血窦大面积淤血（图4P），肝细胞肿胀，脂肪变性，部分细胞坏死、溶解，肝血窦内可见炎性细胞（图4Q）。胰腺细胞轻度坏死（图4R）。

3 讨论与结论

CyHV-2 是危害鲫鱼健康的一种常见病毒，可使机体处于缺氧、营养不足、废物积累的内环境状态，加剧主要的器官组织的损伤，造成鲫鱼大量死亡。本研究发现，感染CyHV-2 后，鲫鱼出现尾鳍末端发白，鳃出血，解剖后腹腔有少量红色腹水等症状。经组织病理学观察发现患病鱼表现为明显的重度坏死性脾炎、中度至重度出血性坏死性鳃炎、重度坏死性肠炎、中度至重度坏死性肾炎、中度坏死性心肌炎和心内膜炎、轻度至中度脂肪肝和轻度坏死性肝胰腺炎，说明脾脏、鳃、肠道、中肾、心脏是其主要靶器官，对肝脏和头肾亦有轻微损伤。2016年林秀秀等[13-14]亦发现感染CyHV-2 的鲫鱼在头肾、脾脏、肠道、肝胰腺、鳃中均出现明显的病理损伤，而本研究进一步明确了鲫鱼感染CyHV-2 后的主要病理靶器官及病变程度，为临床上相关疾病的研究提供了参考。

聚合酶链式反应（PCR）是检测CyHV-2 感染较为常用且精准的方法，可以检测到组织中极微量的病毒DNA[15]。本研究参照T.B.Waltzek[16]的检测方法，该方法能够有效地检测出不同地方的CyHV-2分离株，最终发现本次发病的鲫鱼为CyHV-2 阳性。目前，还有更多的检测方法用于CyHV-2 检测。A.E.Goodwin 等[17]建立了实时定量PCR，此方法特异性强，免疫性高，不仅能在表现临床症状的鱼中检测出CyHV-2 病毒，还可以检测出处于潜伏期的病鱼。He J.等[18]建立环介导等温扩增来检测CyHV-2，证实该方法比传统的PCR 和实时PCR 灵敏度更高。CyHV-2 检测技术仍在发展，未来还有很多更快更好的方法会创造出来，能够在生产一线发挥更大的作用。

CyHV-2 在鱼体内形成潜在的感染源。该病毒的暴发与温度有很大关系，潜伏感染的病毒在温度不适宜时长期潜伏在鱼体内，表现与正常鱼无任何差异。但是当养殖水温升高到22 ℃时，潜伏在鱼体内的病毒被激活，导致宿主开始发病并造成疾病的传播，引起鱼群的大量死亡[19]。因此在春夏季水温升高时，要注意养殖鲫鱼的生长情况，经常打样检测，一旦发现有疑似感染CyHV-2 的症状要及时检测并处理，避免大量暴发造成损失。另外2009年A.E.Goodwind 等[20]证实了CyHV-2 也可垂直传播，因此在养殖过程中需要严格选择亲鱼，并加强对亲鱼场、苗种场的管理。目前，国内外对CyHV-2 携带者的处理尚未有明确的要求和相关的参考，因此当在亲鱼和鱼苗中一旦发现CyHV-2 携带者，必须及时淘汰，避免造成更大的损失。由于我国对于疱疹病毒的研究还处于起步阶段，对于该病的治疗目前尚无特效药。张琳琳等[21]对CyHV-2 灭活疫苗进行相关研究，发现注射疫苗后相对免疫保护力有一定上升，并降低了感染CyHV-2 的异育银鲫死亡率，因此应尽快研制该病毒的灭活疫苗，从源头上控制该病。

图4 患病鲫组织病理学表现Figure 4 Histopathological manifestations of diseased crucian carp