大麦黄绿叶色突变体ygl的农艺性状及其调控基因初步定位

秦丹丹，李梅芳，许甫超，徐 晴，葛双桃，董 静

(1.湖北省农业科学院粮食作物研究所,湖北武汉430064； 2.粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室,湖北武汉 430064)

叶色突变是植物界的一种特殊现象，多在苗期表达，存在多种变异形式，且易于识别；根据苗期叶色，可将这类突变体分为白化、黄化、浅绿、白翠、绿白、黄绿、绿黄和条纹8种类型[1]。在作物中，叶色突变研究多集中于水稻上，迄今已报道了近百个变异类型丰富的水稻叶色突变体(http://www.gramene.org)。我国科学家也在多个水稻材料中发现了各具特色的叶色突变体[2-5]，而且随着水稻基因组测序的完成，通过图位克隆的方法也已成功分离到若干叶色变异调控基因[6-8]。在玉米中，通过不同途径也筛选到多个叶色突变体，并发现相关突变基因涉及电子传递，蛋白质合成、转运和定位，信号传递、能量代谢等生理生化过程[9]。大麦中也报道过多个叶色突变体，如受遗传和环境因素共同控制的大麦叶色转换突变系[10]、来源于裸大麦北青7号EMS诱变库的叶色突变体[11]、经叠氮钠处理获得的叶绿素突变体Viridis、flavoviridis、chlorina、albina[12]、白化突变体albostrians[13]、大麦叶色黄化突变体[14]等。本课题组从鄂大麦6号中发现的阶段性白化突变体whs18，在正常田间生长条件下，叶片表现为绿色-黄化-白化-条纹白-转绿的阶段性变化过程[15]。

大麦黄绿叶色突变体ygl是本课题组从鄂大麦934的EMS突变体库中筛选获得的，连续多年的田间观察发现，该突变体从出苗开始，叶片便呈现黄绿色，后期叶片表现为浅绿色。本研究以正常叶色大麦品种Harrington和黄绿叶色突变体ygl为亲本构建了F2分离群体并对大麦黄绿叶色调控基因HvYGL(yellow green leaf)进行了初步定位，以期为该基因的精细定位和克隆奠定基础，同时为在大麦育种中应用该突变体提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

本研究所用材料为鄂大麦934，以及来源于鄂大麦934 EMS突变体库的黄绿叶色突变体ygl和引自加拿大且与鄂大麦934无任何血缘关系的正常叶色大麦品种Harrington。

1.2 表型观察及性状测定

2014、2015和2016年秋季将材料种植于湖北省农科院粮食作物研究所位于湖北武昌的核心试验地中，生长和管理条件同当季正常材料。正常田间条件下、正常生长季节内(湖北，武昌)收获的ygl和野生型鄂大麦934，随机选取10株考察株高、单株穗数、穗长和穗粒数，取其平均数作为各材料的性状值。随机选取ygl和鄂大麦934的种子100粒进行称重，取三次重复计算平均值，并计算千粒重，从而分析叶色突变对ygl主要农艺性状的影响。利用透射电镜观察并比较野生型和ygl苗期叶片中叶绿体的超微结构，具体步骤参考Qin等[15]的方法。

1.3 大麦黄绿叶色调控基因HvYGL的遗传分析及初步定位

构建ygl和正常叶色大麦Harington的遗传分离群体，对F1、F2及F2:3植株的表型及分离比例进行观察和统计分析，通过卡方测验进行统计学检测，分析该性状调控基因的遗传特性。参照Michelmore[16]等文章中所述BSA方法，从F2分离群体中随机选取10株绿色野生型单株和10株黄绿单株的DNA分别等量混合构建正常性状池和突变性状池，然后将亲本Harrington和ygl间有差异的分子标记在两个池间进行筛选，在不同性状池间存在多态性且与对应亲本一致的标记即为连锁标记。之后利用上述连锁标记分析包含有144个单株(含56个绿株和88个黄绿株)的F2群体的基因型，从而构建HvYGL基因的遗传连锁图谱。其中，DNA提取采用CTAB法，混池及单株的基因型分析采用普通聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳，SSR引物来源于Graingene(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)，由上海Invitrogen公司合成，荧光引物的合成和毛细管电泳分析由武汉天一辉远公司协助进行，遗传连锁图谱构建采用mapmaker3.0软件[15]。

利用连锁标记序列信息，在已公布的大麦品种Morex的基因组序列(http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley_ibsc/viroblast.php)中通过blast搜索其所在的Morex_contig，从而分析其所在的染色体位置及其包含的功能基因等相关信息，并筛选可能的候选基因。

2 结果与分析

2.1 大麦黄绿叶色突变体ygl的叶色及农艺性状表现

通过2014-2015、2015-2016和2016-2017年度连续3年的田间观察发现，在正常生长条件下，大麦黄绿叶色突变体ygl的叶色在整个生育期内都较野生型浅，叶片从苗期开始即呈现黄绿色(图1)，拔节期后逐渐变为浅绿色。对农艺性状进行考察发现，与野生型鄂大麦934相比，ygl株高和千粒重分别呈极显著和显著降低，而单株穗数、主穗穗长、主穗穗粒数等性状无显著差异(表略)。

2.2 大麦黄绿叶色突变体ygl苗期叶片叶绿体的超微结构

对野生型鄂大麦934和黄绿叶色突变体ygl苗期叶片的超微结构进行观察发现，在鄂大麦934的叶片中，基粒类囊体垛叠排列成基粒片层，基粒片层和基质片层沿着叶绿体的纵轴交替排列(图2a)。而ygl叶片中基粒类囊体严重线性化，观察不到完整的基粒片层和基质片层，叶绿体超微结构受损(图2b)。

图1 野生型鄂大麦934与黄绿叶色突变体ygl在苗期(a)和抽穗期前(b)的叶色表现

图2 鄂大麦934(a)和ygl(b)苗期叶片叶绿体的超微结构

2.3 大麦黄绿叶色调控基因HvYGL的遗传分析

为了解该性状的遗传模式，以正常叶色大麦Harrington为母本，以ygl为父本配制了杂交组合，结果发现，F1植株都呈现正常叶色，F2群体中绿苗和黄绿苗的数目分别为251株和88株。卡方测验表明，二者符合3∶1的分离比例(χ2= 0.16，χ2(0.05,1)=3.84)。进一步对F2:3家系的表型进行观察发现，F2表现为正常绿色的单株，其衍生的F3有的表现为纯合绿色，有的则表现为黄绿分离；而F2表现为黄绿叶色的单株，其衍生的F3全部表现为纯合黄绿叶色。以上结果均说明本研究中所关注的大麦黄绿叶色性状是由一个隐性核基因控制的质量性状，将其命名为HvYGL。

2.4 大麦黄绿叶色调控基因HvYGL的初步定位

以上述F2分离群体为定位群体，首先利用均匀分布于大麦7条染色体上的400对SSR引物，通过聚丙烯酰胺凝胶在亲本间进行多态性分析，共获得71对多态性引物。利用以上多态性引物在野生型和突变型混池间进行分析，共获得4对在混池间表现多态性、可能与性状连锁的标记(表1)，Bmag0136、Bmac0209、EBmac0871和Bmag603，均位于大麦3H染色体上。其中，由于EBmac0871和Bmag603在野生型和突变型间的扩增片段长度差异较小，因此，为了更准确地对F2单株进行基因型分析，根据EBmac0871和Bmag603引物序列，合成了荧光标记，通过毛细管电泳分析二者在F2分离群体中的基因型。结果发现，这两个标记在野生型和突变型单株间分别存在4 bp和2 bp的长度差异(图3B)。同时，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Bmag0136和Bmac0209的基因型(图3A)。结合毛细管电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，构建了大麦黄绿叶色调控基因HvYGL的连锁图谱，最终将该基因定位在大麦3H染色体上12.7 cM的区间内(图4)，位于SSR标记Bmag0136和Bmac0209之间，且Bmac0209、EBmac0871、Bmag603在黄绿单株中与HvYGL共分离。

图A为Bmac0209在亲本及黄绿单株中的基因型分析，其中，M为marker， P1为Harrington，P2为ygl，F2黄绿单株为F2分离群体中的黄绿叶色单株；图B为EBmac0871在亲本Harrington和ygl及F2杂合个体中的毛细管电泳图。

Fig.A:Polymorphic analysis ofBmac0209; M:marker; P1:Harrington; P2:ygl; F2yellow-green individuals:Individuals with yellow-green leaves in the F2population；Fig.B:Capillary electrophoresis analysis ofEBmac0871in Harrington,ygland heterozygous individuals from F2population.

图3 连锁标记在F2群体中的多态性分析

图4 HvYGL在大麦染色体上的定位及其连锁图谱

进一步根据上述连锁标记的序列信息在已公布的大麦基因组序列数据库(http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/viroblast.php)中搜索相似序列，将这些标记定位在大麦基因组上(表1)。从表1中可以看出，这些标记位于大麦3H染色体上50.7082～52.0299 cM的区间内，但是对这4个标记所位于的5条Morex_contig的序列进行详细分析，表明这些Morex_contig不包含任何功能基因。

3 讨 论

叶色突变通常由叶绿体结构缺陷和叶绿素代谢异常引起，并因此影响植株的光合作用，最终导致产量降低。特别是不可转绿的白化突变体，往往因为不能正常进行光合作用而最终死亡，因此，叶色突变常被认为是有害的突变。但是，叶色突变体却是解析植物光合作用、光形态建成等过程的理想材料[17-19]。本研究所用的大麦黄绿叶色突变体ygl，在田间种植时，整个生育期内叶色都较野生型浅，特别是在苗期至拔节期，都表现为典型的黄绿叶色，后期则表现为浅绿色。这种叶色异常虽然对单株穗数、穗长和穗粒数没有产生显著影响，但是与野生型相比，ygl的株高和千粒重却显著降低。对叶片中的叶绿体超微结构进行观察发现，ygl叶绿体表现异常，也暗示着ygl叶片的光合作用可能受阻，引起株高和千粒重的降低。

对叶色突变性状的调控基因进行定位和克隆是充分利用这类突变的分子基础。多数叶色突变性状是由单隐性核基因控制的，也有少数是由细胞质基因或者核质基因互作控制的，如小麦返白系的阶段性返白特性[20]和大麦叶绿素缺失突变体CL2所表现的叶色突变[21]。本研究利用正常叶色大麦Harrington和ygl构建了分离群体，对F1、F2分离群体以及F2:3的表型分析发现，ygl所表现出的黄绿叶色是由一对隐性核基因控制的质量性状。进一步利用上述F2群体，通过基于SSR的BSA法将该基因定位在大麦3H染色体上12.7 cM的区间内。本课题组前期所定位的大麦阶段性白化调控基因HvSGRA位于大麦染色体2H的末端，通过测序分析发现FLN1基因翻译的提前终止可能是导致该现象产生的原因[15]。Wang等则将调控大麦高温诱导的黄化的基因定位在4H染色体上[22]。因此，本研究所报道的黄绿叶色调控基因HvGYL不同于以上所报道的大麦叶色调控基因。李志勇[14]也在大麦3H染色体上检测到一个调控大麦黄化叶色的基因ylm-1，至于该基因与本研究所定位的HvGYL是否为同一个基因，还需要进一步验证。

本研究进一步利用已公布的大麦基因组序列，对HvGYL连锁的分子标记进行分析发现，它们位于大麦染色体3H上约1.3 cM的区间内。但是对这些标记所处的Morex_contig序列进行分析发现，它们不包含任何功能基因。一方面可能是由于本研究中所用作图群体较小，而且分子标记类型为SSR，导致未能筛选到与基因紧密连锁的分子标记。另一方面，虽然从这4个分子标记在大麦基因组上的位置来看，它们间的距离仅1.3 cM，而在黄绿单株中与HvYGL共分离的三个标记Bmac0209、EBmac0871和Bmag603仅相距0.1 cM，但是，由于大麦基因组庞大且包含大量重复区域，这0.1 cM的遗传距离中除了表1中的5条Morex_contig外，还可能包含多条Morex_contig。因此，在接下来的研究中，将通过扩大群体、加密图谱以及高通量测序等策略进行HvYGL基因的精细定位和图位克隆，这有助于综合阐明大麦黄绿叶色形成的分子机理，为将其应用于农业生产提供理论依据。