响应面法优化黄芪总黄酮提取工艺及初步纯化

袁惠君，李 欣，贾鸿震，袁毅君

（1.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃省轻工研究院有限责任公司，甘肃 兰州 730000；3.天水师范学院，甘肃 天水 741000）

中药黄芪为豆科黄芪属植物蒙古黄芪(Astragalus membranaceusvar.mongholicus)或膜荚黄芪(A.membranaceus)的根[1]，富含多糖、皂苷和总黄酮等多种生物活性成分，其中总黄酮主要包括毛蕊异黄酮、芒柄花素及其糖苷成分，具有抗辐射、清除氧自由基、抑菌、增强机体免疫和抗病毒等功能[2-3]，常作为保健因子添加到食品中，也是饲料中常用的生长免疫增强剂成分，在水产养殖和畜牧业上被广泛应用，具有增强免疫，提高动物生产性能、产品品质等功效[4]。

黄芪总黄酮提取最常规的方法是乙醇回流法[4]，但由于不同产地药材活性成分性质的差异，其提取工艺参数不同。单因素法和Box-Behnken响应面设计法是优化提取工艺研究常用的方法[5-6]，其中响应面法是一种采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析寻求最优工艺参数的统计方法，具有试验周期短，回归方程精度高，能分析多种因素交互作用等优点，已被广泛用于各种工艺参数的优化[5]。

总黄酮的纯化方法主要有大孔吸附树脂法、硅胶柱层析法、聚酰胺柱层析法和葡聚糖凝胶柱层析法等[7]，其中大孔吸附树脂法因其吸附量大、解析率高、选择性强和成本低等优点成为黄酮类、生物碱等多种活性成分提取的有效方法之一[8]，但也存在因部分黄酮不溶于水而难以富集纯化的问题[9-11]。聚酰胺是一类以酰胺键聚合而成的高分子化合物，主要通过大量酰胺基与黄酮类化合物的酚羟基形成氢键而进行吸附，可除去色素和部分脂溶性化合物，可有效弥补大孔吸附树脂的部分不足[12-13]。

黄芪药材来源驳杂，全国不同地方常用同属植物的根都作为黄芪，甘肃黄芪以宕昌和陇西产的药材在外观性状和有效成分含量方面最优[14-15]，但其详细的分离纯化工艺研究未见报道。本研究以甘肃宕昌产黄芪为材料，通过单因素试验和响应面分析对黄芪总黄酮最佳提取工艺进行研究，并利用HPD722大孔吸附树脂-聚酰胺柱层析联用法进行富集纯化，以期为深入研究黄芪总黄酮产品的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

黄芪产自甘肃省陇南市宕昌县哈达铺。芦丁纯度为91.7%，购自中国食品药品检定研究院。毛蕊异黄酮和芒柄花素纯度分别为99.08%和99.03%，均购自成都曼思特生物科技有限公司。乙醇、氯仿、正丁醇、H2O2、苯酚、浓硫酸等均为分析纯；聚酰胺(过孔径450 μm样品筛)和HPD722大孔吸附树脂购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司。

1.1.2 仪器设备

电热恒温水浴锅(HH-4型，京科伟永兴仪器有限公司)，高效液相色谱仪(Agilent 1100，美国安捷伦公司)，紫外分光光度计(UV-1800，日本岛津公司)，天平(AE260，瑞士梅特勒公司)，超纯水机(AFX2-0501-P，颐洋企业发展有限公司)，高速多功能粉碎机(CXP-100，上海市晟喜制药机械有限公司)，超声波清洗器(SK3310LHC，上海科导超声仪器有限公司)，远红外快速干燥箱(766-3，江苏省南通县金余电器配件厂)，旋转蒸发仪(RE-5299，巩义市予华仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 黄芪总黄酮提取

黄芪药材粉碎后过孔径450 μm样品筛，准确称取2 g，置于100 mL圆底烧瓶中，参考预试验，按一定料液比加入不同乙醇体积分数，80 ℃水浴回流提取一定时间，过滤后定容至25 mL，即为黄芪总黄酮粗提液。

1.2.2 黄芪总黄酮粗提液含量测定

标准曲线制作：称取芦丁10 mg，用40%乙醇溶解并定容至50 mL，即为芦丁对照品(0.204 mg·mL-1)。取10 mL具塞比色管7只，分别吸取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL芦丁对照品，用40%乙醇补至5 mL，混匀后加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，静置6 min。加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，混匀后静置6 min。最后加入4 mL 4% NaOH溶液，用40%乙醇定容10 mL，混匀后静置15 min。以40%乙醇为空白，在510 nm处测定吸光值[16]。以浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，吸光值A(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，Y= 0.012 2X- 0.008 2，r= 0.999 8。芦丁含量在5.1～61.2 μg·mL-1范围内具有良好的线性关系。黄芪总黄酮粗提液含量的测定同法操作。提取量(mg·g-1) = 粗提液中总黄酮含量/药材质量。

1.3 单因素试验

准确称取2 g黄芪药材粉，置于100 mL圆底烧瓶中，在料液比为1∶15，提取时间90 min，乙醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%和80%条件下，测定总黄酮提取量，分析乙醇体积分数对黄芪总黄酮提取量的影响；在乙醇体积分数为70%，提取时间90 min，料液比(g∶mL)分别为1∶9、1∶11、1∶13、1∶15、1∶17、1∶19 条件下，测定总黄酮提取量，分析料液比对黄芪总黄酮提取量的影响；在乙醇体积分数为70%，料液比为1∶17，提取时间分别为 20、40、60、80、100和120 min条件下，测定总黄酮提取量，分析提取时间对黄芪总黄酮提取量的影响。每试验重复3次。

1.4 响应面试验

在单因素试验基础上，利用Design-Expert8.0.6.1软件中的Box-Behnken设计进行响应面优化设计，以乙醇体积分数、料液比和提取时间为响应变量，黄芪总黄酮提取量为响应值，设计3因素3水平，共17个试验点。试验因素水平如表1所列。

1.5 大孔吸附树脂富集黄芪总黄酮

大孔吸附树脂预处理：称取适量HPD722树脂，用95%乙醇充分浸泡过夜，除去树脂中的碎片和杂物后乙醇湿法装柱，用乙醇持续冲柱，随时检查流出液，冲至与水混合不呈白色浑浊为止，然后用大量蒸馏水洗掉层析柱内乙醇，备用。称取100 g经过预处理的HPD722大孔吸附树脂，取上述最佳条件下制备的黄芪总黄酮浓缩液，调整浓度为0.71 mg·mL-1，pH 3.0，依据预试验，上样速度为2 mL·min-1，上样体积为3柱床体积(bed volume，BV)，4 BV蒸馏水除杂，6 BV 70%乙醇解吸附，收集解析液并旋转蒸发得黄芪总黄酮[17]。

1.6 聚酰胺树脂富集黄芪总黄酮

聚酰胺预处理：称取适量聚酰胺树脂，用95%乙醇充分浸泡过夜，乙醇湿法装柱，用乙醇持续冲柱，随时检查流出液，冲至与水混合不呈白色浑浊为止，然后用大量蒸馏水洗掉层析柱内乙醇，备用。称取30 g经预处理后过孔径450 μm样品筛的聚酰胺，参考预试验，上述黄芪总黄酮以1 mL·min-1上样1 BV，30%乙醇3 BV除杂，90%乙醇3 BV解吸附，收集解析液60 ℃旋转蒸发得黄芪总黄酮[18]。

1.7 毛蕊异黄酮和芒柄花素含量测定

色谱条件参考文献[19]：色谱柱为Agilent TC-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈 (A)和 0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱程序为0-15 min 30%A和70% B，15-35 min 65% A和35% B；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为254 nm；柱温25 ℃；进样量为 20 μL。

精密称取3份0.1 g纯化的黄芪总黄酮粉末，均用流动相A溶解定容至25 mL，分别进样20 μL测定，利用外标法计算黄芪总黄酮主要成分毛蕊异黄酮和芒柄花素含量。

1.8 数据统计分析

采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Design-Expert 8.0.6.1软件进行响应面分析并绘制响应曲面图，Origin7.5软件制图。

表1 Box-Behnken因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

2 结果与分析

2.1 单因素试验

随着乙醇体积分数增加，黄芪总黄酮提取量显著增加(P＜ 0.05)，并在乙醇体积分数为70%时达到最大，然后随乙醇体积分数增加而降低(图1a)，这是因为当乙醇体积分数为70%时，黄芪总黄酮溶出趋于饱和，随后其他醇溶性或脂溶性物质开始溶出，从而使黄芪总黄酮提取量下降[20]。故乙醇体积分数选择70%。

当料液比(g∶mL)在1∶9～1∶17范围内，黄芪总黄酮提取量随料液比增加而增加(P＜ 0.05)，并在料液比(g∶mL)1∶17时达到峰值，随后继续增加料液比，因其他醇溶性杂质开始逐渐溶出，导致黄芪总黄酮提取量反而下降(图1b)。因此，料液比(g∶mL)以1∶17为最佳。

随提取时间的延长，黄芪总黄酮提取量显著增加(P＜ 0.05)，但在60 min以后提取量增幅减小(图1c)，表明提取时间60 min时大部分黄芪总黄酮已溶出，继续延长提取时间，可能导致黄芪总黄酮被氧化[21]。因此，选择最佳提取时间为60 min。

2.2 响应面试验结果

基于表1 响应面设计进行的试验结果如表2所列。通过Design-Expert 8.0.6.1 软件进行响应面分析后得到以黄酮提取量为响应值的回归方程为Y=2.72 + 0.13A+ 0.076B+ 0.031C - 0.027AB+ 0.058AC+0.13BC- 0.66A2- 0.27B2- 0.072C2。如表3所列，二次回归模型P＜ 0.000 1，失拟项P= 0.768 7 ＞ 0.05，决定系数R2= 0.980 7，校正系数Radj2= 0.955 9，与决定系数R2接近，说明该模型回归显著、准确，与试验结果拟合度良好。F值越大表明该变量对黄酮提取量的影响越大[22]，因此3种因子对黄芪总黄酮提取量的影响依次为乙醇体积分数 ＞ 料液比 ＞提取时间。BC交互作用显著影响黄芪总黄酮提取量(P＜ 0.05)，而AB、AC交互作用不影响黄芪总黄酮的提取量 (P＞ 0.05)。

2.3 响应面分析

比较3组等高曲线图可知：乙醇体积分数和料液比对黄芪总黄酮提取量的影响显著，表现为曲线陡峭(图2a、图2b)，表明黄芪总黄酮提取量对各参数的变化较敏感；提取时间影响不显著，曲线表现较为平缓圆润(图2c)，说明黄芪总黄酮提取量对提取时间的变化不敏感[23]，与方差分析结果相一致。

图1 乙醇体积分数、料液比和提取时间对黄芪总黄酮提取量的影响Figure 1 Effects of ethanol concentration,solid/liquid ratio,and extraction time on the extraction content of TFA

表2 Behnken试验方案及结果Table 2 Experimental design and results with Box-Behnken

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

图2 两因素交互作用的响应面分析Figure 2 Response surface of three interacting factors

回归模型预测分析表明，黄芪总黄酮最佳工艺条件为乙醇体积分数71.17%，料液比(g∶mL) 1∶17.5，提取时间69.6 min，总黄酮提取量最大预测值可达到2.75 mg·g-1。为方便实际操作，将最优条件简化为乙醇体积分数70%，料液比(g∶mL) 1∶17，提取时间70 min，该条件下进行3次平行验证试验，黄芪总黄酮提取量达到2.78 mg·g-1(表4)，RSD为1.41%，与模型预测值误差为1.09%。说明该模型可较好地预测黄芪总黄酮提取量，优化结果可靠，可用于指导黄芪总黄酮的提取工艺。

2.4 黄芪总黄酮主要组分的含量

经过HPD722大孔吸附树脂和聚酰胺联用富集后，黄芪总黄酮提取量可达310.63 mg·g-1，富集112倍，回收率分别为94.11%和80.19%；其主要组分毛蕊异黄酮和芒柄花素含量分别为42.56 和7.89 mg·g-1，分别富集327倍和132倍。

3 讨论与结论

由于黄芪黄酮已在保健品、饲料方面被广泛应用，其提取工艺研究已有文献报道。肖卫华等[24]最先用响应面法研究了黄芪总黄酮提取工艺，在提取温度75 ℃，提取时间2.5 h，乙醇体积分数88.3%，液固比 25 mL·g-1条件下，提取量为 0.98 mg·g-1。最近，刘少静等[4]用单因素和正交试验的研究表明，在乙醇体积分数85%，料液比(g∶mL) 1∶20，温度80 ℃回流提取2.5 h条件下，黄芪总黄酮提取量可达2.39 mg·g-1。但上述工艺的提取量均低于本研究的2.78 mg·g-1，可见该工艺具有一定的推广应用价值。

正交设计和均匀设计是在天然产物分离纯化工艺研究方面应用较多的传统设计方法。正交设计能在尽量减少试验次数的情况下在多因素多水平组合中找出最佳因素水平组合，但不能给出因素和响应值之间明确的函数表达式，也不能全面地反映各因素之间的交互作用[25]。均匀设计最大化地追求均匀性达到减少试验次数为目的，但是当试验次数少于因素个数时，采用多重回归的方法来研究响应变量随自变量的变化的回归方程就不是唯一的，而且其在试验设计时不考虑全部交互作用，只有通过回归分析时引入因素之间的交叉乘积项等来进行探索，因此，其结果不够稳定[5,25]。本研究采用Box-Behnken设计，共重复5个中心点，充分考虑了各因素间及各因素与响应值间的相互作用，提高了试验精度，验证试验结果与模型预测值误差仅为1.09%。本研究中乙醇体积比对提取结果的影响大于料液比，与刘少静等[4]的研究结果一致。

表4 黄芪总黄酮主要组分的含量Table 4 Content of the main components in TFA of Astragalus membranaceus

大孔吸附树脂和聚酰胺均是分离纯化总黄酮类物质的常用材料，但其吸附机理不同，各有优缺点[26]。严柳叶等[27]和丁艳霞等[28]的研究表明，单纯利用上述任何一种材料分离纯化，总黄酮富集纯化效果均不及大孔吸附树脂和聚酰胺柱层析联用。本研究选用HPD722弱极性大孔吸附树脂和聚酰胺进行联用富集，充分发挥了HPD722的弱极性与黄酮分子内疏水部分有较强吸附作用的特点，以及聚酰胺可截留黄芪色素和部分脂溶性成分，且经过水洗可除去部分水溶性杂质等特点，较好地结合了两者优势，得到良好的纯化效果。本研究通过单因素试验，研究了乙醇体积分数、料液比和提取时间对黄芪总黄酮提取量的影响，并采用响应面分析法对提取工艺进行优化，建立了回归模型，表明在乙醇体积分数70%，料液比(g∶mL)1∶17，80 ℃提取70 min的条件下，黄芪总黄酮提取量可达2.78 mg·g-1；经过HPD722大孔吸附树脂和聚酰胺大孔吸附树脂联用富集后，黄芪总黄酮提取量可达310.63 mg·g-1，高于其他文献报道[29]，富集倍数为112；其主要组分毛蕊异黄酮和芒柄花素含量分别为 42.56 mg·g-1和 7.89 mg·g-1，富集倍数分别为327倍和132倍。上述结果表明，该提取工艺和富集纯化方法合理，可为黄芪总黄酮的提取和工业化生产提供参考。