奶牛场环境中气载金黄色葡萄球菌的耐药性分析与散播试验

白燕雨,刘家祺,熊云梅,段晋伟,郭 耀,乔婷婷,唐 芳,霍乃蕊,古少鹏

(山西农业大学动物科技学院,山西 太谷 030801)

金黄色葡萄球菌(S.aureus)对人和牛等多种动物均具有易感性,致病性强,分布广泛,对外界环境抵抗力强[1],并可形成微生物气溶胶广泛散布于养殖场内外环境空气中[2],是奶牛养殖过程中的主要致病菌之一。养殖环境中致病菌的广泛分布与散播,不仅影响圈舍内动物的健康,同时也给养殖场工作人员和周边居民带来威胁,引起严重的公共卫生问题[3]。随着抗生素被广泛用于治疗由金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病,导致耐药菌株和多重耐药菌株的出现[4],加剧了该病的防治难度。

研究表明,猪场中S.aureus可通过微生物气溶胶传播[5],鸡粪中的S.aureus可通过微生物气溶胶散播于鸡场环境和场外下风向中[6];段会勇[7]等的检测显示,兔舍中的S.aureus可长时间停留在舍内空气中,借助气流等外界因素传播到舍外一定距离,并可通过呼吸道进入人畜体内引起发病。

本试验从奶牛场内、外环境以及牛场粪土中分离、鉴定S.aureus,通过耐药性监测和ERIC-PCR技术,分析牛场内、外环境中金黄色葡萄球菌耐药情况和气载S.aureus的散播特点,以期为牛场环境控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 奶牛场基本概况 奶牛场周围为农田,场内建有圈舍、挤奶间、运动场、饲料间、员工休息区;圈舍为半开放式双排结构,饲养密度为50头/栋;圈舍内自然通风,建有粪尿收集坑道;每日06：00～08：00、18：00～20：00挤奶两次,全天自由采食饮水;圈舍每日定时打扫和投放饲料。

1.3 方法

1.3.1 样本采集及处理 粪土(Dungsoil)样本：采集奶牛运动场中多处混合粪土,以1∶9的比例用无菌生理盐水稀释,摇床中充分震荡混匀,吸取100 μL均匀涂布于5%绵羊血琼脂平板,37℃恒温培养18～24 h。

牛场内、外环境空气样本：使用Andersen-6级标准空气微生物采样器采集空气样本,采集基质为5%绵羊血琼脂平板,分别于牛舍内(Inform)、牛场外上风向10 m处(Upwind 10 m)、下风向10 m、50 m、100 m处各选取3个采样点,每次3 min,每点3个重复。

1.3.2S.aureus的分离纯化 挑取血平板上符合S.aureus生长特性的疑似菌落,革兰染色镜检,将革兰阳性球菌,接种到BP培养基进行选择纯化培养,选取BP培养基上黑色周围有灰白色圈的菌落在营养肉汤中增菌培养[8]。

1.3.3 DNA的提取和PCR鉴定 使用细菌基因组提取试剂盒提取菌落DNA,利用16S rRNA分析技术[9]对S.aureus进行分子鉴定。金黄色葡萄球菌ATCC25923作为阳性对照菌株,白色葡萄球菌(26101-19)作为阴性对照。

参考文献[10]设计引物,引物序列为：P1：5′-GCGGTCGCCTCCTAAAAG-3′ P2： 5′-TCCCGGTCCTCTCGTACTA-3′

扩增反应体系为25 μL：2 ×EasyTaqPCR Super-Mix 12.5 μL,去离子水 10 μL,DNA 模板 1.5 μL(100 ng/μL),上下游引物各0.5 μL。反应条件为：94℃预变性4 min,94℃变性30 s,57.5℃退火40 s,72℃延伸40 s,共35个循环,72℃延伸10 min,4℃ 保存[10]。取10 μl的PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统拍照后分析结果。

1.3.4 药敏试验 选择12种临床常用抗生素对分离鉴定的S.aureus菌株采用纸片扩散法进行药敏试验,试验操作及判定参照美国CLSI抗菌药物敏感性试验执行标准。

1.3.5 ERIC-PCR指纹图谱分析 参考文[11]献设计 ERIC-PCR 引物,引物序列为：ERIC-1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′

扩增反应体系同1.3.3。反应条件为：94℃预变性5 min,90℃变性30 s,52.5℃退火60 s,72℃延伸60 s,共32个循环,72℃延伸10 min,4℃保存[11]。取10 μL的PCR扩增产物进行1.8%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统拍照。对ERIC-PCR指纹图谱进行处理,标记产物条带并生成矩阵图,构建遗传关系进化树图。将每个菌株对应的图谱作为一个分类学单位,认为遗传相似系数≥90%的菌株来源相同[12]。

2 结果与分析

2.1S.aureus的分离鉴定结果 经分离纯化培养和革兰染色镜检粗筛出株疑S.aureus71株。通过16S rRNA保守序列分析技术对疑似菌进行PCR分子鉴定,扩增的目的片段为450 bp左右,检测出51株阳性菌株含有与标准S.aureus标准株相同的目的片段,确定为S.aureus,其中在粪便样本中检出16株,牛舍空气样本中检出21株,牛场外下风向10 m、50 m和100 m处分别检出6株、4株和4株,在牛场上风向空气样本中未检测出S.aureus。见图1。

2.2 药敏试验结果 所有分离的S.aureus对P-G的耐药情况最为严重,耐药率为100%,其次是SXT、STR、TOB、RIF、TET,耐药率分别为 64.7%、45.1%、33.3%、29.4%、23.5%。其中粪土、牛场内、场外下风空气中S.aureus对SXT的耐药率分别为100%、57.14%、35.71%,对STR的耐药率分别为56.2%、42.9%、35.7%,对TOB的耐药率分别为37.5%、33.3%、28.57%,对RIF的耐药率分别为43.75%、28.57%、14.28%,对TET的耐药率分别为37.5%、19.05%、14.29%,对CFP的耐药率分别为25%、9.52%、7.1%,对GEN的耐药率分别为18.75%、9.52%、14.28%,对NOR的耐药率分别为31.25%、9.52%、7.14%,对 ERY的耐药率分别为 0、0、14.28%,对Ni的耐药率分别为6.25%、0、42.85%,见表1。

图1 S.aureus PCR鉴定结果

表1 S.aureus药敏结果

对51株S.aureus的多重耐药分析发现：检测菌株的多重耐药率为76.5%(39/51),多重耐药种数主要集中在2耐～7耐之间,有2株菌对8种以上抗生素耐药,见图2。

图2 S.aureus多重耐药结果

2.3S.aureus的ERIC-PCR指纹图谱分析 ERICPCR扩增得到S.aureusDNA指纹图谱,应用NTSYS-pc2.10分析软件构建遗传关系进化图,得到各菌株之间的遗传相似系数。被测菌株在遗传相似度上整体被分为两大分支,其中牛舍空气和运动场粪土中分离的21株S.aureus中有19株菌遗传相似系数≥90%;牛场外下风向与牛场粪土和牛舍空气中有7株菌遗传相似系数≥90%,见图3。

图3 采样点分离株聚类分析图

3 讨论

3.1 牛场环境中S.aureus的危害S.aureus是重要的环境致病菌,是引起牛急性、慢性乳房炎的主要病原,并可通过空气侵染人和动物呼吸系统引起气管炎、肺炎,化脓性炎症[1]。本研究在同一时间段从牛舍空气、牛场粪土和牛场外环境样本中分离出71株疑似S.aureus,经16S rRNA保守序列分析技术鉴定出51株S.aureus,检出率分别为70%(21/30)、88.9%(16/18)、58.3%(14/24)。 根据 Andersen-6级空气收集器的采样特点,后期我们分析发现,分离得到的S.aureus大约70%可进入人和牛体肺泡,对牛和养殖人员造成很大的潜在威胁。其中牛场粪土中的S.aureus分离率明显高于牛舍和牛场外空气,所以在实际养殖过程中要及时清除牛舍和运动场的粪便,重视牛舍环境空气消毒。上风向采样点中未分离出S.aureus,这可能与上风向S.aureus浓度较低有关,而且风向、温度等外界环境因子也会影响S.aureus的存活力[3],这与钟召兵[6]等人在鸡场的上风向10 m、50 m处均未检出S.aureus的结果一致;在牛场下风向50 m、100 m处均检出S.aureus,提示S.aureus可随气流在一定范围内散播[2],所以在牛养殖场选址上应该尽量远离居民区、生活水源等。在奶牛场粪土和牛舍空气中都检测到大量的S.aureus,这不能排除牛场其他生产环节中存在S.aureus的可能性,在奶牛养殖过程中,这部分S.aureus可通过破损的表皮黏膜、毛囊、消化系统及呼吸系统侵入动物机体,引起局部化脓感染,甚至败血症,还可污染奶源,经食物链引起人的食源性感染[1]。

3.2S.aureus的耐药性 该牛场环境中的S.aureus多重耐药现象严重,对P-G均耐药,对SXT、STR、TOB、RIF、TET有不同程度的耐药,流行病学调查显示,S.aureus耐药谱与牛场临床用药基本相符,故在临床治疗中应根据药敏试验结果选取抗生素。粪土、牛舍、牛场外下风空气中S.aureus对ERY的耐药率分别为0、0、14.28%,牛舍内未检出对ERY耐药的S.aureus,但在场外下风向中检出2株对ERY耐药的S.aureus,提示该菌株可能来源于养殖场周围环境;场外下风向中耐NiS.aureus的检出率明显高于粪土和场内空气中,说明部分S.aureus可能来源于养殖场周围环境。牛场下风向与牛场粪土和牛舍空气分离的S.aureus耐药谱有一定程度的一致性,提示这部分S.aureus是通过牛场微生物气溶胶随空气向周边环境散播的。

3.3S.aureus亲缘性分析 对S.aureus遗传相似系数比较分析发现,牛舍空气中90.5%(19/21)、牛场外空气中50%(7/14)的S.aureus与粪土中的S.aureus遗传相似系数≥90%,表明奶牛养殖场内、外环境空气中的S.aureus主要来源于粪土,该结论也在S.aureus耐药性中得到。粪土中的S.aureus可经过一定的理化过程进入空气,形成微生物气溶胶散布于牛舍中,并借助气流等外力的影响散播到养殖场下风向空气中。牛舍空气中有9.5%(2/21)的S.aureus与粪土中的S.aureus遗传相似系数≤85%,提示这部分的菌株可能来源于牛体或带菌的养殖人员;牛场外空气中50%(7/14)的S.aureus与粪土中的S.aureus遗传相似系数≤85%,提示养殖场外环境空气体中的S.aureus部分来源于牛场,也有部分来源于周边外环境。