入侵植物喜旱莲子草对铜绿微囊藻的化感作用研究

程萌 李丹 张猛

摘  要：为了探究控制微囊藻暴发以及喜旱莲子草综合利用的方法，以喜旱莲子草（Alternanthera philoxeroides）为供体，铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）为受体，利用喜旱莲子草不同部位的乙醇浸提液对铜绿微囊藻进行室内控制培养，分析其生长状态。结果表明：（1）与对照组相比，喜旱莲子草乙醇浸提物对铜绿微囊藻的生长具有明的显抑制作用，藻体数量降低36.95%～95.14%;微囊藻溶液相对电导率增加0.50%～29.19%;（2）微囊藻溶液叶绿素a含量随着浸提物浓度增加呈现出不同的效应，在低浓度（c≤70g/mL）时表现为促进，叶绿素a含量增加19.41%～762.99%;高浓度（c>70g/mL）时表现为抑制，溶液中叶绿素a降低10.15%～75.94%;（3）除喜旱莲子草地上部分浸提物在最高浓度（280g/L）影响下，微囊藻溶液COD增加12.43%外，而其他浓度处理（≤140g/L）使微囊藻溶液COD降低13.15%～66.84%;（4）通过比较不同指标的化感效应指数表明，喜旱莲子草不同部位浸提液的化感作用强弱不同，表现为地下部分浸提物化感作用明显强于地上部分。

关键词：入侵生物;化感作用;浸提物;喜旱莲子草;铜绿微囊藻

中图分类号 Q948.12+2.1文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）12-0032-4

Abstract：In order to explore resource utilization of a invasive plant and biological control of the Microcystis，indoor bioassay was adopted to study the allelopathic effects of a invasive plant，namely Alternanthera philoxeroides，on Microcystis aeruginosa. The results show that：（1）The ethanol extracts of A. philoxeroides significantly inhibited the growth of M. aeruginosa significantly，and the extracts reduced the number of M. aeruginosa by 36.95%-95.14%;the relative electric conductivity of M. aeruginosa increased 0.50%-29.19%;（2） the concentration of the ethanol extraction of A.philoxeroides has significant difference on the chlorophyll of Microcystis solution，the change of chlorophyll under different controls shows a trend of promotion in low concentration （c≤70g/L） and inhibition in high concentration（c>70g/L） content;（3） the effect of 280g/mL extract of aboveground organization of the host plant had more significant difference on COD of Microcystis solution than others，the COD of the solution under 280g/mL increased by 12.43%，while the index under other controls decreased by 13.15% to 66.84% compared with the control;（4） compared with RI of different controls of the extracts of A. philoxeroides，the inhibition of allelopathy from belowground organizations was stronger than of allelopathy from aboveground parts at the same concentration.

Key words：Invasive species;Allelopathic effect;Ethanol extraction;Alternanthera philoxeroid;Microcystis aeruginosa

喜旱蓮子草（Alternanthera philoxeroides），又名空心莲子草，俗称“水花生”，为苋科、莲子草属多年生宿根性草本植物。该物种原产于巴西，其生命力顽强，适应性强，广泛分布于多个国家和地区[1]。20世纪30年代引种至中国，目前已经在我国28个省市区均有分布[2]。由于其自身的生物、生态学特性，该植物生长迅速，具有明显的竞争能力，易于对入侵地的生态环境、生产生活等产生负面影响[3-4]。

近年来，针对该入侵植物的综合利用与防治的研究，越来越引起人们的关注[5]。喜旱莲子草常被用作肥料、动物饲料，食用菌培养基原料也可作为生物质能源发展沼气，同时可以用于水质净化。研究表明，喜旱莲子草通过其植株的化感作用[6-8]，影响其他生物的生长。

现阶段，随着我国水体富营养化程度的加剧，在巢湖、滇池等湖泊中“水华”暴发频繁，有害藻中以蓝藻和绿藻在数量和发生频率上均占有优势[9]，在藻细胞死亡或细胞膜通透性增强时会向水中释放藻毒素，破坏水质，导致生态系统失衡，危害人体健康[7]。因此，如何抑制蓝藻的生长、控制水体富营养化已成为水污染治理的研究热点和亟待解决的问题。为此，国内外很多研究者进行了相关研究，开展了控制水华暴发不同方法的研究[10]。笔者在野外进行巢湖水体污染水体状况调查中发现，在喜旱莲子草密集生长水体中蓝藻数量普遍较少甚至没有。据此，笔者假设喜旱莲子草的化感物质对蓝藻的发生具有一定的影响，存在一定的抑制作用。

本实验以入侵植物喜旱莲子草为供体，以铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）为受体，研究喜旱莲子草不同器官乙醇浸提物对于其生长的影响，为综合利用入侵植物喜旱莲子草以及控制微囊藻引发的水华现象等方面研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料选择 2013年8月，在合肥市蜀山区四里河路至潜山路南淝河段岸边挖取喜旱莲子草完整植株，洗净晾干，分拣地上与地下部分备用。2013年8月，在安徽巢湖第4取水口捞取蓝藻，稀释20倍后在显微操作台上分离出铜绿微囊藻备用。

1.2 研究方法

1.2.1 微囊藻培养 选择培养藻类常用BG-11培养基[7]。将100mL培养基置于250mL锥形瓶中，高压蒸汽灭菌锅灭菌处理15～20min，向培养基内加入已分离出的铜绿微囊藻，然后放入人工气候箱，温度（25±1）℃、光照2000lx、光周期16L∶8D，对微囊藻进行扩大培养，每天晃动2次。

1.2.2 制备喜旱莲子草浸提物 将分离完成的喜旱莲子草地上部分和地下部分分别置于烘箱内105℃烘干，粉碎。参考文献提取方式，取70g干物质通过100mL 95%乙醇利用索式提取器进行提取，将提取液过3层纱布过滤处理放入旋转蒸发仪蒸发至膏状，密封，置于4℃冰箱内保存待用。

1.2.3 材料处理及培养 将BG-11培养基100mL放置于250mL灭菌过的锥形瓶，加入扩大培养的铜绿微囊藻溶液3mL，再次扩大培养14d。将喜旱莲子草的地上、地下部分浸提物物用75mL蒸馏水配置成母液（280g/L），然后稀释成140g/L、70g/L、35g/L、17.5g/L等不同浓度溶液，实验中设置蒸馏水做空白对照组（0g/L）。实验共设置11组处理，每组5个重复。分别取以上11组溶液3mL加入到微囊藻溶液中，每天摇动3次。实验过程中为避免灰尘及其它微生物的干扰，对使用材料均进行灭菌处理，且均在无菌条件下进行操作，继续培养14d后，观察其生长状况并测定其生长指标。

1.3 指标测定及方法

1.3.1 藻溶液铜绿微囊藻数量 采用显微镜计数法，取培养后的藻溶液1mL，稀释20倍后用血球计数板计数测定铜绿微囊藻数量。每重復组取样计数3次，取平均值作为该重复组样品计数结果。

1.3.2 藻溶液相对电导率 取5mL混匀的藻溶液，在室温下测定其电导值S1（DDS-12A型电导仪（上海）），再将上述试管置于水浴锅加热（100℃）30min，冷却至室温，测定其电导值S2，最后计算叶片相对电导率。计算公式为：

相对电导率（%）=S1/S2×100 [11] （1）

1.3.3 藻溶液叶绿素a含量 分别取各处理组藻溶液2mL分别置于10mL离心管中，于12000离心5min，用移液枪吸去上清液。藻饼于2mL 80%丙酮中重悬浮，后用锡箔纸完全包裹10mL离心管，并置于光线较暗处55℃水浴放置30min，后于12000rpm离心5min，吸出上清液转移至10mL刻度试管中，并用80%丙酮定容于5mL，测定663nm处的光吸收值，测定结果按照CA=OD663/82，计算溶液叶绿素含量（mg/L）[6]。

1.3.4 藻溶液COD的测定 将经过处理的微囊藻溶液进行40倍稀释，并取20mL稀释后的微囊藻溶液置于250mL磨口的回流锥形瓶中。通过重铬酸盐法（GB/T11914—1989）测定微囊藻培养液COD。

1.3.5 化感效应评价 参照Williamson等的方法进行浸提物化感效应评价[12]，即：

RI<0表明为抑制作用，RI>0表明为促进作用，绝对值的大小表示化感作用的强弱。

1.4 数据分析 本实验中所有数据均使用Excel 2003整理，通过SPSS 17.0软件进行LSD多重比较与单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 喜旱莲子草浸提物对铜绿微囊藻数量的影响 由表1可知，与对照组相比，喜旱莲子草浸提物对铜绿微囊藻数量具有显著的化感抑制作用（P<0.05，RI<0），且各处理组之间具有显著差异（P<0.05）。喜旱莲子草地上部分浸提物使铜绿微囊藻数量降低50.55%～95.14%，而该植物地下部分浸提物使微囊藻数量降低36.95%～92.73%。通过化感效应指数分析，发现喜旱莲子草不同部位浸提物对铜绿微囊藻数量均具有明显抑制作用，且抑制强度随着喜旱莲子草浸提物浓度的升高而增加。

2.2 喜旱莲子草浸提物对藻溶液叶绿素a含量的影响 通过测定喜旱莲子草浸提物处理的微囊藻溶液内叶绿素a含量，表明不同部位浸提物对微囊藻溶液的叶绿素a含量有明显影响作用（表2）。其中，喜旱莲子草地上部分的浸提物在低浓度时（c≤70g/L）使微囊藻的叶绿素a增加64.24%～762.99%，而在高浓度时则使微囊藻的叶绿素a降低51.67%～60.03%。与对照相比，喜旱莲子草地下部分的乙醇浸提物在较低浓度（c≤70g/L）时叶绿素含量增加19.41%～26.50%，较高浓度（c>70g/L）时微囊藻的叶绿素含量降低10.15%～75.94%。从化感效应指数来看，喜旱莲子草浸提物均在低浓度时促进了溶液叶绿素a含量的提高，而在高浓度处理条件下则表现为抑制作用。表明随着该入侵植物浸提物浓度的增加，微囊藻溶液叶绿素a含量呈先降低后增加的趋势。

2.3 喜旱莲子草浸提液对微囊藻溶液相对电导率的影响 微囊藻溶液的相对电导率在浸提物浓度增加的过程中表现为逐渐降低（表3）。与对照相比，喜旱莲子草地上部分浸提物使微囊藻的相对电导率增加2.92%～29.19%;而地下部分浸提物使微囊藻的相对电导率增加0.50%～11.82%。通过化感效应指数，喜旱莲子草不同部分乙醇浸提物相同浓度处理下，地上部分对微囊藻相对电导率的化感作用较强。

2.4 喜旱莲子草浸提液对微囊藻溶液化学需氧量的影响 由表4可知，与对照组相比，随着喜旱莲子草地上部分乙醇浸提物浓度的增加，微囊藻溶液COD呈现先降低后增大的趋势，而地下部分浸提物浓度的下降，使微囊藻溶液COD呈现降低的趋势。各处理间相比，除喜旱莲子草地上部分浸提物在最高浓度（280g/L）影响下微囊藻溶液COD增加了12.43%以外，而其他浓度处理（≤140g/L）使微囊藻溶液COD降低13.15%～66.84%。通过化感效应分析表明，除地上部分在280g/L浓度处理时使溶液COD增加即表现为化感促进作用外，其余处理条件下均为化感抑制作用（RI<0）。

4 结论与讨论

藻类数量的大小是最能反映藻类生长状况的一个指标[13]。本研究中发现：喜旱莲子草浸提物对溶液内微囊藻数量具有明显的抑制效应，浸提物浓度越低，则微囊藻数量降低的幅度越大。这可能是由于浸提物中所含有的部分有机物达到一定浓度时，通过固定藻类细胞使其失去生命活力，也可通过降低藻类光合作用而抑制藻类生长最终杀灭藻类细胞[13]。另外，喜旱莲子草浸提物的添加可能遮挡了微囊藻溶液的部分光照，导致实验过程中光强下降，降低光合水平，从而对藻类生长产生抑制作用[14]。

叶绿素是光合作用的原料[15，16]，藻類叶绿素含量的高低直接反映出藻类生长中光合作用程度的高低。通过藻类抑制实验，可作为评价受试物对藻类的“短期抑制效应”的指标[16]。而藻类进行光合作用的物质基础叶绿素a表示光合作用的强弱，用于表征藻类的存活状况及生物量的大小[17]。本实验中，喜旱莲子草浸提物在低浓度时增加微囊藻溶液叶绿素a含量，而在较高浓度时则会抑制叶绿素a的含量。这是由于当喜旱莲子草浸提物浓度增加到一定程度时，会产生聚集成团的现象，会超出藻细胞的自我调节能力，造成叶绿体结构的破坏，从而影响藻类生长[7]。该实验中发现低浓度浸提物会促进藻类叶绿素a的含量，这可能是由于浸提物刺激了微囊藻体内某些酶的活性，从而促进了藻类的生长[18]。

相对电导率是反应细胞膜系统状况的一个重要生理生化指标[19]，往往在植物受到胁迫时，会导致相对电导率的变化。受环境胁迫越大，细胞膜透性增大，电解质等物质渗漏，进而引起组织的电解率发生变化，从而电导率越大[20]。因此，藻类细胞膜通透性的增加可以作为衡量植物胁迫程度的指标。本研究中发现，喜旱莲子草浸提物使微囊藻溶液的相对电导率显著增加，这可能是由于藻类在逆境状态下细胞膜容易受到损伤而破裂，进而导致细胞液外渗而增大相对电导率。

化学需氧量可以作为反应水中还原物质多少的一个指标，水中主要的还原物质为有机物、亚硝酸盐、硫化物等。化学需氧量越小，表明水污染程度越轻[21-22]。本研究中发现，在喜旱莲子草浸提物处理条件下微囊藻溶液的COD显著下降，这可能是由于喜旱莲子草浸提物影响藻类生长，从而降低了水中有机物的含量。

外来种一般都有较强的适应性和宽广的生态幅，从而能够在入侵地生态系统中成功入侵[23-24]。目前的研究表明，石菖蒲、梭鱼草、大薸等植物对铜绿微囊藻具有明显化感效应[17，19，25]，同时也发现喜旱莲子草对不同植物也表现出明显的化感作用[6，26]，这为探讨该入侵植物的综合利用与防治提供了很好的思路和切入点。本研究发现，喜旱莲子草浸提物对铜绿微囊藻具有一定的化感抑制作用，但该入侵植物的化感物质是否能够成为防治蓝藻的有效措施，还需要进一步深入分析化感抑制作用的活性物质及其作用机制，从而更好地为喜旱莲子草的综合利用以及蓝藻的生态控制提供理论支持。

参考文献

[1]李洁，蒋娜，范雪涛，等.空心莲子草化感效应的初步研究[J].种子，2007，26（12）：32-35.

[2]陈立立，余岩，何兴金.喜旱莲子草在中国的入侵和扩散动态及其潜在分布区预测[J].生物多样性，2008，16（6）：578-585

[3]林金成，强胜，吴海荣.外来入侵杂草空心莲子草对植物生物多样性的影响[J].农村生态环境，2005，21（2）：28-32

[4]张震，徐丽，朱晓敏.喜旱莲子草对不同生境植物群落多样性的影响[J].草业学报，2010，8：10-15

[5]李丹，徐丽，张震，等.喜早莲子草的利用及其生物防治研究进展[J].中国农学通报，2013，29（01）：71-75.

[6]张震，徐丽，马艳婷.喜旱莲子草组织水浸提液对黑麦草种子和幼苗的化感效应[J].西北植物学报，2009，29（1）：0148-0153.

[7]田如男，孙欣欣，魏勇.不用类型水生植物群落对铜绿微囊藻的化感作用[J].生态环境学报，2010，19（9）：2149-2154.

[8]林金成，强盛，吴海荣，等.水花生[Alternanthera philoxeroides（Mart.）Grised][J].杂草科学，2003（3）：36-38.

[9]叶良涛，钱家忠，左胜鹏，等.不同营养水体对喜旱莲子草化感抗藻的影响[J].草业学报，2012，21（2）：279-284.

[10]周笑白，张宁红，张咏，等.太湖蓝藻的时空变化规律及治理方法[J].生态环境学报，2013，22（12）：1930-1935.

[11]陈建勋，王晓峰.植物生理学实验指导（第二版）[M].广州：华南理工大学出版社，2006：64-66.

[12]Williamson G B，Richardson D. Bioassays for Allelopathy：Measuring Treatment Responses with Independent Control[J].Journal of Chemical Ecology，1988，14（1）：181-187.

[13]马艳芝，王向东.青苔去除剂对温室盆花栽培基质中藻类数量的影响[J].江苏农业科学，2009，1：161-163.

[14]朱小山，朱 琳，田胜艳，等.三种金属氧化物纳米颗粒的水生态毒性[J].生态学报，2008，28（8）：3507-3516.

[15]贾若凌.铜胁迫对菊芋幼叶生理生化指标的影响[J].河南农业科学，2012，41（8）：154-156.

[16]Aruoja V，Dubourquier H C，Kasemets K，et al..Toxicity of nanoparticles of CuO，ZnO and TiO2 to microalgae Pseudokimhnenella subcapitata[J].Science of the Total Environment，2009，407（4）：1461-1468.

[17]辛元元，陳金媛，程艳红，等.纳米TiO2与重金属Cd对铜绿微囊藻生物效应的影响[J].生态毒理学报，2013，8（8）：23-28.

[18]鲜啓鸣，陈海东，邹惠仙，等.沉水植物中挥发性物质对铜绿微囊藻的化感作用[J].生态学报，2006，26（11）：3849-3854.

[19]陈爱葵，韩瑞宏，李东洋，等.植物叶片相对电导率测定方法比较研究[J].广东教育学院学报，2010，30（5）：88-91.

[20]丁惠君，彭祺，张维昊，等.三种湿生植物对微囊藻的化感作用初步分析[J].环境科学与技术，2007，30（4）：7-10.

[21]吕卓，谢冰，徐亚同.青草沙水源地水库藻类监测预警指标体系研究[J].环境科学与技术，2011，34（10）：118-122.

[22]张刚，王兆菡，张立卿.停留时间对富含藻类水厂排泥水污泥调质的影响[J].济南大学学报，2005，19（2）：159-162.

[23]万方浩，郭建英，王德辉.中国外来入侵生物的危害与管理对策[J].生物多样性，2002，10（1）：119-125.

[24]廖周瑜，赵则海，侯玉平，等.五爪金龙对薇甘菊的化感效应研究[J].生态环境，2007，16（3）：939-943.

[25]张维昊，周连凤，吴小刚，等.菖蒲对铜绿微囊藻的化感作用[J].中国环境科学，2006，26（3）：355-358.

[26]须海丽，杨宇，耿广东.空心莲子草浸提液对3种蔬菜种子萌发的化感效应[J].山地农业生物学报，2008，27（6）：547-549.

（责编：张宏民）