医院制剂水合氯醛口服溶液微生物限度检查方法的建立

曾蔚欣　刘敏　刘俊丽　

[摘要] 目的 建立有效、简单、经济的医院制剂水合氯醛口服溶液微生物限度检查方法，并用建立的方法对3个批次的样品进行微生物限度检查。 方法 依据现行《中国药典》2015年版四部通则的相关要求，选用薄膜过滤法进行样品的前处理，选用5种菌株进行方法学验证。 结果 微生物计数检查的5种菌种的回收率均在0.5～2.0范围内，控制菌检查大肠埃希菌合格。 结论 水合氯醛口服溶液的微生物限度检查方法经验证符合2015年版《中国药典》的要求。

[关键词] 水合氯醛口服溶液;薄膜过滤法;微生物限度检查;方法学验证;中国药典2015年版

[中图分类号] R927.33          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）05（c）-0096-04

[Abstract] Objective To establish an effective， simple and economical microbial limit test method for Chloral Hydrate Oral Solution of hospital preparations， which was used to carry out microbial limit test for three batches of samples. Methods According to the related requirement of the four general rules of the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia， membrane filtration was used for sample pretreatment. 5 strains were selected for methodological verification. Results The recovery ratio of the five strains of microbial counts were within the range of 0.5 to 2.0， and Escherichia coli tested by control bacteria was qualified. Conclusion After verification， the microbial limit test for Chloral Hydrate Oral Solution can meet the requirements of the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia.

[Key words] Chloral Hydrate Oral Solution; Membrane filtration method; Microbial limit test; Methodological verification; 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia

首都醫科大学附属北京世纪坛医院（以下简称“我院”）制剂水合氯醛口服溶液为口服溶液剂，可用于治疗失眠、烦躁不安及惊厥[1]，也是辅助检查前常用的镇静药，其吸收率高，胃肠刺激轻，起效速度快，且与全身麻醉的成本效益比较，更加经济方便[2-4]。微生物污染是影响药品生产质量和引发药品不良反应的重要因素之一，因此，为了保证药品的质量，必须对药品进行微生物限度检查，检查方法也应根据药典的变化及时更新。根据2015年版《中国药典》微生物限度检查法的规定[5]，口服溶液剂的需氧菌总数应不得超过102 cfu/mL，霉菌和酵母菌数应不得超过101 cfu/mL，大肠埃希菌每1 mL不得检出。本制剂的原质量标准微生物限度检查方法为2010年版《中国药典》的检查方法，随着2015年版《中国药典》的正式实施，医院制剂的质量标准也应随之提高，检查方法也应随之更新，真正达到标准严格、质量可控，以保证用药安全。本文参考了相关文献[6-9]，建立了适合于本品的微生物限度检验方法，并根据2015年版《中国药典》四部的要求[5]，对我院制剂水合氯醛口服溶液进行了微生物限度检查的方法学适用性试验，使该制剂的质量标准提升至现行药典的水平，并用建立的方法，对3批样品进行了微生物限度检查，以期为该类药物的微生物检验提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

BT125D千分之一电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）;YXQ-LS-50SⅡ自动高压蒸汽灭菌器（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）;SW-CJ-IFD超净工作台（浙江孚夏医疗科技有限公司）;BSC-110 0IIA2-X生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司）;SPX-250电热恒温培养箱30～35℃（康恒仪器实验室设备有限公司）;SPX-1000电热恒温培养箱42～44℃（江苏天翎仪器有限公司）;SPX-250电热恒温培养箱42～44℃（苏州江东精密仪器有限公司）;薄膜过滤器（上海那艾精密仪器有限公司）;三目显微镜（日本奥林巴斯公司）;VITEK2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统（法国梅里埃生物制品有限公司）。

1.2 供试品

水合氯醛口服溶液（批号分别为20170704、2017 0705、20170706）由我院制剂室提供。

1.3 菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均来自中国食品药品检定研究院，且菌株传代次数均不超过5代。

1.4 培养基

胰酪大豆胨液体培养基（TSB，批号：1703062）;胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，批号：1702032）;沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，批号：1702242）;麦康凯液体培养基（MacB，批号：160801）;麦康凯琼脂培养基（MacA，批号：1510009）;稀释液为0.9%无菌氯化钠溶液（批号：1603072）。以上厂家均为北京陆桥技术有限公司生产，适用性检查符合要求。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备方法

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、谷草芽孢杆菌：分别将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、谷草芽孢杆菌接种至胰酪大豆胨液体培养基中，置于35℃培养箱中，培养24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌量为103～104 cfu的混悬液。

白色念珠菌：取白色念珠菌接种至胰酪大豆胨液体培养物中，置于25℃培养箱中，培养24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌量为103～104 cfu/L的混悬液。

黑曲霉：将新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，置于25℃培养箱中，培养7 d，加入含0.05%（V∶V）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液5 mL，洗下孢子并收集孢子悬液，制成含霉菌孢子数为103～104 cfu/L的黑曲霉孢子混悬液。

2.2 供试液的制备

取水合氯醛口服溶液两瓶，混合均匀，作为供试品原液。取供试品原液10 mL，加入0.9%无菌氯化钠溶液至100 mL，混合均匀，即为1∶10的供试液。

2.3 需氧菌总数计数方法适用性试验

①试验组：取供试品原液1 mL，加入0.9%无菌氯化钠溶液100 mL中，混合均匀，按照《中国药典》[5]2015年版四部通则1105项下非无菌产品的微生物限度检查法进行试验，采用薄膜过滤法过滤，用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次，每次约100 mL。在最后一次冲洗中用注射器注入1 mL 50～100 cfu的试验菌液，待薄膜过滤器中无冲洗液后，取出滤膜，将薄膜菌面向上放置于制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基平皿中央，每种试验菌株平行制备2个平皿，测定需氧菌总数。接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌时，在33℃培养箱中培养3 d;接种白色念珠菌和黑曲霉时，在33℃培养箱中培养5 d。②供试品对照组：取供试品原液1 mL，同试验组操作，不加入试验菌液，测定供试品本底的需氧菌总数。③菌液对照组：取0.9%无菌氯化钠溶液100 mL代替供试品同试验组操作，测定菌落数。④回收比值的计算：根据试验结果按下列公式计算：回收率（%）=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数×100%[10-11]。结果显示：3批水合氯醛口服溶液，采用薄膜过滤法进行平行测定，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉、白色念珠菌的回收率均在0.5～2.0范围内，提示水合氯醛口服溶液的需氧菌检查方法适用性验证合格。见表1。

2.4 霉菌及酵母菌总数计数方法适用性试验

①试验组：按照“2.3”项下的试验方法进行操作，将薄膜菌面向上放置于制备好的沙氏葡萄糖琼脂平皿中央，每种试验菌株平行制备2个平皿，置于20～25℃培养箱中培养24～120 h，逐日观察结果并计数。②供试品对照组：取供试品原液1 mL，同试验组操作，不加入试验菌液，测定供试品本底的需氧菌总数。③菌液对照组：取0.9%无菌氯化钠溶液100 mL代替供试品同试验组操作，记录菌落数。④回收比值的计算：根据试验结果按下列公式计算，回收率（%）=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数×100%。结果显示：3批水合氯醛口服溶液，采用薄膜过滤法进行平行测定，黑曲霉和白色念珠菌的回收率均在0.5～2.0范围内，提示水合氯醛口服溶液的霉菌及酵母菌总数计数方法适用性验证合格。见表2。

2.5 控制菌检查方法适用性试验

①试验组：取上述1∶10的供试液10 mL，按照“2.3”项下试验方法进行操作，取滤膜加至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中并混匀，在33℃培养箱中培养18 h。取上述培养物1 mL，接种至麦康体培养基100 mL中，混匀，在43℃培养箱中培养48 h，取培养物划线接种于麥康凯琼脂平板上，在33℃培养箱中培养18 h，每日观察菌落生长结果。②供试品组：取1∶10的供试液10 mL，采用薄膜过滤法，冲洗方式同需氧菌总数项下，在最后一次冲洗中用注射器注入1 mL稀释液代替菌液同试验组操作。③阴性对照组：取0.9%无菌氯化钠溶液10 mL替代供试液，按试验组操作进行试验。结果显示：供试品对照组和阴性对照组均未检出大肠埃希菌，而试验组检出试验菌，提示水合氯醛口服溶液的控制菌检查方法适用性验证合格。见表3。

2.6 水合氯醛口服溶液中国药典2015年版微生物限度检查

水合氯醛口服溶液微生物限度检查结果：3批样品的需氧菌总数均<1 cfu/mL（标准规定：不得超过102 cfu/mL）;霉菌和酵母菌总数均<1 cfu/mL（标准规定不得超过101 cfu/mL）。大肠埃希菌1 mL中未检出（标准规定：1 mL中不得检出）。见表4。

3 讨论

医疗机构制剂是医疗机构根据本单位的临床需要，经批准后配制的自用药品，是对市场药品供应的有益补充，是临床有使用需要，但市场上尚未供应的药品[12]。微生物限度检查是衡量药物受污染程度的重要指标，与药物的安全性有着密切的关系[13-14]，微生物限度检验的方法也应随着药典的变化及时更新。与2010年版《中国药典》比较，2015年版《中国药典》在微生物限度检查方法方面，结合现有国情，并借鉴欧美药典先进经验技术，在培养基的使用、菌种的选择、回收率测定、计数方法等方面都做出了重大修行[15-19]，并且，要求更为严格，确保检验结果更准确、更严谨，更倾向于与国际标准接轨[20]。根据2015年版《中国药典》[5]规定，口服溶液剂应建立微生物限度检查方法，并进行方法学验证，以保证检查方法的准确性和可靠性。因此，本文根据现行药典的微生物限度检查的相关要求，对我院20170704、20170705、20170706 3个批次的水合氯醛口服溶液进行了研究与验证，经过平行试验，建立了可靠、稳定的微生物限度检查方法。本试验试验组菌落数回收率均在0.5～2.0范围内，控制菌检查大肠埃希菌合格。结果显示，水合氯醛口服溶液微生物限度检查方法学验证合格，符合现行《中国药典》（2015年版）[5]的要求，可为相关制剂的微生物方法验证提供参考与借鉴。

[參考文献]

[1]  北京市食品药品监督管理局.北京市医疗机构制剂规程：第一册[M].北京：中国商业出版社，2014：142-143.

[2]  王倩，许静，季兴.门诊患儿安全应用水合氯醛镇静的经验[J].药学与临床研究，2018，26（1）：63-65.

[3]  吴颖，王旭梅.水合氯醛用于婴幼儿镇静的研究进展[J].实用临床护理学电子杂志，2018，3（25）：128-129.

[4]  林晓芳.水合氯醛溶液院内用于儿童人群的规范化管理与风险防控探讨[J].中国现代医生，2018，56（16）：109-111.

[5]  国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].四部.北京：中国医药科技出版社，2015：136-151.

[6]  闵红，杨晓莉，李翠，等.复方氯己定地塞米松膜微生物检查方法学研究[J].中国抗生素杂志，2018，43（7）：881-886.

[7]  戴宇婷，倪兆武，侯晋芳.口服补液的微生物限度检查方法学验证[J].中国药物经济学，2017，12（2）：20-22.

[8]  田怀平，王玲，杜毅，等.射干合剂2015年版《中华人民共和国药典》微生物检查方法适用性研究[J].中国中医药信息杂志，2017，24（10）：72-75.

[9]  古丽巴哈尔·托乎提，艾山·艾比布勒，张明君，等.5种蒙药医院制剂微生物限度检查方法建立及探讨[J].食品安全质量检测学报，2018，9（10）：2522-2526.

[10]  田怀平，林志燕，李超，等.两种硫间苯二酚洗剂微生物限度检查的方法建立及适用性研究[J].中国药物应用与监测，2018，15（1）：9-12.

[11]  文玉辉，韩珍珍.11种医院制剂微生物限度检查方法验证[J].临床医药实践，2015，24（10）：763-765.

[12]  岳毅桦.2012-2017年医疗机构制剂使用情况与发展趋势[J].中国药物经济学，2018，13（10）：28-31.

[13]  宏伟，杨开金.药品微生物限度检查误差分析及应对措施[J].北方药学，2018，15（10）：182-183.

[14]  佘凡，许占鸽.药品微生物限度检验误差的影响因素及应对策略[J].中国卫生标准管理，2018，9（18）：100-102.

[15]  冯震，范一灵，杨美成.《中华人民共和国药典（2015年版）》（四部）中微生物检验相关通则的增、修订情况介绍[J].上海医药，2016，37（7）：11-15.

[16]  柴海毅.浅析微生物计数方法的回收率[J].医药工程设计，2013，34（1）：30-31.

[17]  由亚宁，陈雪芹，周志云，等.2005年版《中国药典》和《欧洲药典》菌落计数培养基比较[J].中国药事，2010， 24（6）：587-589.

[18]  李红.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析[J].全科口腔医学杂志：电子版，2019， 6（2）：26，30.

[19]  李思，易伟，吴晶晶，等.不同中药制剂微生物限度检查方法学的研究[J].中国医药导报，2018，15（27）：98-101.

[20]  贾辉，姚东，王作君，等.《中国药典》2010版与2015版微生物限度检查法对两种制剂检测结果的比较研究[J].实用药物与临床，2019，22（2）：169-173.

（收稿日期：2018-09-29  本文编辑：张瑜杰）