花生远缘杂交后代的氨基酸含量变异分析

彭振英，单 雷，张智猛，李新国,4*，万书波

(1. 山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室，山东 济南 250100；2. 山东省花生研究所，山东 青岛 266100； 3. 山东省农业科学院，山东 济南 250100；4. 农业农村部华东地区作物栽培科学观测实验站，山东 济南 250100)

花生是我国三大油料作物之一，近年年种植面积500万hm2，年产超过1700万t，总产居油料作物之首，在保障我国食用油脂安全中具有举足轻重的地位。花生不仅具有较高的含油量(50%左右)，其蛋白含量也很丰富[1]，而且抗早、耐瘠、适应性广、高产。在相同栽培条件下，其单位面积生产的蛋白量比大豆高2～3倍[2]。以山东省每年花生种植面积70万hm2、荚果产量4.5t/hm2计算，折合年产花生米220万t(按出米率70%计)，折合蛋白(按蛋白含量28%计)61.7万t。因此我国开发利用花生蛋白的潜力很大。

一直以来，有关花生品质方面的研究主要集中在油脂合成方面，并取得了一定的进展[3-7]，而对花生蛋白方面的研究则很少[1]。栾文琪等人于1988年对379份山东省花生种质的蛋白质含量及氨基酸组分进行了分析，结果表明花生籽仁蛋白质含量平均为30.13%，在17种氨基酸中含量最高的为谷氨酸，平均为5.42%；其次为精氨酸、天冬氨酸和亮氨酸，最低的为蛋氨酸[1]。芦春斌等人对两种不同蛋白质组成类型的花生种子的氨基酸成分进行了比较，得到了类似结论，且认为不同类型种子的氨基酸含量存在显著差异[8]。上述分析表明，花生种子中存在17种氨基酸，但不同品种间氨基酸含量各不相同。

在花生种子发育过程中，脂类、蛋白和糖类三大营养物质的代谢是相互关联的，三者可以通过三羧酸循环相互转化，因此无论研究哪个代谢途径，都与其他二者密切相关。研究表明，花生种子中油脂含量与蛋白含量呈负相关[9]。栽培花生的遗传多样性较低，对少数种质材料的过度利用使栽培花生的遗传背景非常狭窄，适应性降低。因此在目前状态下，要通过常规杂交实现花生品种新突破，获得高产、高抗、优质花生新品种是非常困难的。野生花生种质资源十分丰富，具备许多栽培花生不具备的优良性状，如抗病性、抗逆性等。有的野生花生具有花多、花期长、结果多、品质优等特点，具有重要的应用价值[10]。因此，挖掘野生花生的优异基因资源，将这些新基因导入栽培花生中，拓宽花生的遗传背景，对于栽培种花生的遗传改良具有重要意义。

利用黑花生(ArachishypogaeaL.)×A.monticola做杂交，获得了一个高产花生株系(命名为YZJ-K6-81)，种子大小约为黑花生的2倍。利用桂花红(A.hypogaeaL.)与A.monticola杂交，也获得一个高产株系(YZJ-M41-95)，种子大小约为桂花红的一半。本研究对这两个杂种后代种子的氨基酸成分与含量进行了检测，以期为利用远缘杂交创制高产优质花生新品种提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

2018年收获的黑花生、桂花红、YZJ-K6-81和YZJ-M41-95花生干种子。黑花生和桂花红为普通花生品种，本实验室自存材料。黑花生株型直立，百仁重53.4 g。桂花红株型直立，百仁重51.7 g。YZJ-K6-81为黑花生与A.monticola远缘杂交后代F4代材料，半匍匐型，百仁重92.8 g。YZJ-M41-95为桂花红与A.monticola远缘杂交后代F4代材料，半匍匐型，百仁重25.0 g。

1.2 试验方法

1.2.1 水解氨基酸与游离氨基酸的测定

参照标准：中华人民共和国食品安全国家标准。GB 5009.124-2016 食品安全国家标准食品中氨基酸的测定[11]。

1.2.2 氨基酸分析色谱条件

所用仪器为美国安捷伦公司生产的液相色谱仪(型号：AG1100)。分析方法为OPA FMOC柱前衍生化法。色谱柱参数：(250×4.6)mm，5μm，ODS HYPERSIL。柱温40℃。流速1.0 mL/min。紫外检测器：338 nm，262 nm (Pro, Hypro)。

2 结果与分析

2.1 水解氨基酸类型与含量

从花生种子中总共能够检测到17种水解氨基酸(表1)。其中含量最高的是谷氨酸，其次是天冬氨酸和精氨酸，三者总和占水解总氨基酸含量的46.55%，其次是亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸，三者含量均超过1 g/100g。含量最低的是胱氨酸，含量仅为0.1 g/100g左右。水解总氨基酸含量在这四个花生品种(系)差异较大，桂花红含量最高，而YZJ-M41-95最低。

2.2 游离氨基酸类型和含量

从花生种子中总共能够检测到20种游离氨基酸(表2)。其中含量最高的仍然是谷氨酸，其次是苯丙氨酸和精氨酸，三者总和占游离总氨基酸的41.78%，接近一半。含量最低的是胱氨酸、色氨酸和组氨酸，三者含量均不到10mg/100g。游离总氨基酸含量在这四个花生品种(系)差异较大，黑花生含量最高而YZJ-K6-81最低。

表1 花生种子中水解氨基酸类型和含量 (g/100g干重)

注：表中数据为二次重复结果，同表2。

Note: Data in the table are result of two repeats. The same as table 2.

表2 花生种子中游离氨基酸的类型和含量 (mg/100g干重)

表3 四个花生品种(系)中水解氨基酸和游离氨基酸的变异系数分析

对比表1可以发现，花生种子中游离氨基酸的种类比水解氨基酸多3种，分别是色氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。色氨酸含量在花生种子中极低，仅4～6 mg/100g。谷氨酰胺和天冬酰胺的含量稍高，分别在15～34 mg/100g和35～50 mg/100g范围之内。花生种子中游离氨基酸含量远远低于水解氨基酸，游离氨基酸含量仅为水解氨基酸含量的1.7%～3.2%，表明花生种子中绝大部分的氨基酸存在于蛋白质和多肽中。

2.3 花生种子中氨基酸成分的变异分析

从表3可以看出，在17种水解氨基酸中，变异系数超过20的为脯氨酸和精氨酸；9种氨基酸的变异系数在15～20之间，5种氨基酸的变异系数在10～15之间；甲硫氨酸的变异系数最低，仅为5.696，显示出甲硫氨酸含量在不同花生品种(系)中的稳定性。

在20种游离氨基酸中，变异系数均较大(表3)。除天冬酰胺和色氨酸外，其余18种游离氨基酸含量的变异系数均超过20，其中5个超过40，苯丙氨酸和天冬氨酸含量的变异系数甚至超过50，反应出游离氨基酸含量变化程度之大。但是，由于游离氨基酸所占比例较小，其变化对于整个花生种子中总氨基酸含量的变化来说，影响不大。

2.4 远缘杂交后代与其亲本之间水解氨基酸成分的变异分析

在水解氨基酸方面，黑花生与其杂种后代YZJ-K6-81的17种氨基酸以及总氨基酸含量基本相同(表1)，大部分氨基酸含量的变异系数都比较低，在0.08～3.00之间(表4)。只有5种氨基酸含量的变异系数大于3，最高的为胱氨酸，为10.87；其次是酪氨酸，为7.59；然后是甲硫氨酸、精氨酸和丝氨酸，分别为5.38、4.23和3.89。

而桂花红与其杂种后代YZJ-M41-95的17种水解氨基酸与总氨基酸含量相差很大(表1)，YZJ-M41-95总氨基酸含量为19.12 g/100g干重，仅为桂花红的66.2%。各种氨基酸含量的变异系数都较大(表4)，最低的是甲硫氨酸，为5.98；其次是胱氨酸，为11.83；其余氨基酸含量的变异系数均超过20，最大的为脯氨酸，变异系数达到37.58。这些结果表明，远缘杂交对其杂种后代氨基酸含量的影响因株系而异，有的株系遗传稳定性较高，而有的株系变异较大。

表4 远缘杂种后代与其亲本的水解氨基酸变异系数分析

3 讨 论

花生是我国重要的油料作物，2016年山东省花生荚果总产量达321.56万t[12]，可以折合花生油约112.3万t，蛋白质约62.9万t，可见花生蛋白开发利用的空间很大。但是到目前为止，有关花生蛋白合成的机理研究却相对滞后。

我国花生以油用为主，50%以上用于榨油。从世界花生生产和利用的整体情况来看，全世界花生总量的近40%用于食用及食品工业，美国花生总量的70%以上用于食品工业。目前我国花生食品工业发展很快，对花生的食用品质提出了新要求，主要表现在风味品质和营养品质两方面。风味是人们通过视觉、嗅觉、味觉对花生产品的综合评价。有人认为，氨基酸和碳水化合物是炒花生风味的前体物质，天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸等都与炒花生的典型风味有关[13]。花生的营养价值较高，其能值为2.36 kJ/100g种仁。实验表明，用含16.7%花生蛋白的脱脂饼粕饲喂老鼠，老鼠的生长速度与用12%～24%的酪蛋白饲喂效果相等[14]。但是花生蛋白质中所含人体必须氨基酸距离优质蛋白质标准还有一定差距，特别是赖氨酸、色氨酸、苏氨酸含量偏低。因此，食用花生品种的选育应注意提高蛋白质含量(30%左右)，对氨基酸成分方面也应注意提高赖氨酸、色氨酸、苏氨酸的含量。

目前为止，我国已选育出一批高蛋白花生品种，如泉红花1号[15]、福花8号[16]、吉花19[17]、黔花生六号[18]等，蛋白质含量均在30%以上。但是目前有关花生蛋白方面的研究也仅限于蛋白含量与水解氨基酸成分检测[1,8]。本文通过对花生种子中水解氨基酸和游离氨基酸用液相色谱仪进行分析，检测结果与前人基本一致，水解氨基酸中以谷氨酸、天冬氨酸和亮氨酸含量较高，三者总和占水解总氨基酸含量的46.55%。花生种子中存在20种游离氨基酸，其中含量较高的是谷氨酸、苯丙氨酸和精氨酸，三者的总和占游离总氨基酸含量的41.78%。但是花生种子中的氨基酸绝大多数存在于蛋白质和多肽中，游离氨基酸所占比例较小。

远缘杂交是创制花生新种质的一种重要手段，我国利用远缘杂交技术相继培育出一批具有优良性状的花生品种[19-21]。本实验室利用野生花生与栽培品种杂交，获得了一些具有优良性状的花生材料，如YZJ-K6-81和YZJ-M41-95，二者均具有高产的特点。试验检测结果表明，不同株系间氨基酸含量的变异系数有较大差异。黑花生与其杂种后代YZJ-K6-81的17种氨基酸以及总氨基酸含量差异均不明显，而桂花红与其杂种后代YZJ-M41-95的差异十分显著，表明远缘杂交对其不同后代株系氨基酸含量的影响差异较大。与桂花红相比，YZJ-M41-95总氨基酸含量为19.12 g/100g干重，仅为桂花红的66.2%。已有研究表明，花生种子中油脂含量与蛋白含量呈负相关，蛋白质含量与含油量占种子总重的80%左右, 一种成分的增加会伴随着另一种成分的降低[9]。由此推测，YZJ-M41-95油脂含量会比桂花红有显著提高。因此，应该把油脂合成与蛋白合成进行联合研究，才能对花生品质性状形成的遗传基础有更深入的了解。