铁皮石斛2个P型H+-ATPase基因的克隆、表达及生物信息学分析

黑小斌，李 欢，李依民，沈 霞，高 静，颜永刚，张 岗

(陕西中医药大学 药学院，陕西省秦岭中草药应用开发工程技术研究中心，西安 712046)

ATP酶(ATPase)是一类对小阳离子以及磷脂具有特异性的转运蛋白。植物ATPase因转运Zn+、Cu+、Ca2+、Na+、K+、Mn+、H+等离子特性而分为P1～P5 五种类型[1]。H+-ATPase属于P3类型，可水解ATP产生能量而进行逆浓度梯度运输H+，又称为质子泵。根据亚细胞定位差异，H+-ATPase主要分为线粒体内膜和叶绿体类囊体膜F型(Factor-type)、液泡膜V型(Vacuolar-type)、质膜P型(Plasma membrane-type)3种类型[2]。

P型H+-ATPase通过磷酸化或去磷酸化水解ATP建立电化学梯度并形成离子和代谢物跨膜转运的原初动力，被称为植物细胞的“主宰酶”[3]。研究表明，P型H+-ATPase与植物的生长发育密切相关，广泛参与植物细胞pH稳态、细胞伸长、气孔开闭及响应环境胁迫等生物学过程[4]。极度缺磷时，拟南芥P型H+-ATPase AHA家族成员高度表达，AHA2在根伸长区调节初生根的伸长，AHA7调控根毛形成[5]。在拟南芥保卫细胞中过量表达AHA2增强了光诱导的气孔开放程度并促进了转基因植株的生长[6]。转NpPMA4的烟草耐盐能力显著提高[7]。此外，P型H+-ATPase还参与调控植物-微生物互作。在水稻、苜蓿-丛枝菌根共生系统中，OsHA1和MtHA1能促进宿主对无机磷养分的吸收[8]。

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是兰科最为珍稀的石斛属多年生草本植物，以新鲜或干燥茎药用，有益胃生津、滋阴清热等多种功效，是重要的名贵中药材之一[9]。铁皮石斛因多种活性成分而具备多种药理活性，石斛多糖作为其指标成分之一，具有抗衰老、抗炎、抗肿瘤和提高免疫力等作用[10]。前期，本研究组构建了真菌侵染石斛种子共生萌发的抑制性差减杂交cDNA文库，筛序获得大量差异基因[11]。其中，2条序列C1168和C223，分别为750 bp和 1 149 bp，与植物H+-ATPase家族成员相似性大于84%。鉴于P型H+-ATPase在植物生理代谢过程中的重要作用，本研究以这2条序列为基础，利用RACE克隆铁皮石斛2个P型H+-ATPase基因全长DoPMA1和DoPMA2，进行表达模式和生物信息学分析，为进一步发掘其分子功能与机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料和取样

野生铁皮石斛采自浙江金华(2017年10月)，由陕西中医药大学张岗教授鉴定为兰科石斛属铁皮石斛。铁皮石斛幼苗正直营养生长时期，株高(10±2)cm，取根、茎、叶，液氮速冻后置于 -80 ℃保存备用。

1.2 总RNA提取和cDNA合成

按照EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒(北京爱德莱)说明提取各样品总RNA，RQ1Rnase-free DNaseI (Promega, USA)消解去除基因组DNA；NanoDropTM2000(Thermo Fisher, USA)测定RNA质量、纯度，琼脂糖凝胶电泳检测完整性。使用M-MLV Reverse Transcriptase kit(Promega, USA)反转录合成第一链cDNA，-20 ℃保存备用。

1.3 RACE反应和RT-PCR验证

BLASTx分析表明C1168编码一段H+-ATPase的中间肽段，N端和C端都不完整，因此需要进行3′-RACE和5′-RACE克隆DoPMA1全长。C223编码H+-ATPase N段317个氨基酸，C端缺失，因此需进行3′-RACE克隆DoPMA2全长。根据C1168和C223序列设计基因特异引物，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clotech, Japan)说明书，与试剂盒UPM引物组合进行各自RACE反应 (表1)。

表1 引物及其序列Table 1 Primer and sequences used in this study

1.4 序列分析

使用相关在线网络工具对DoPMA1和DoPMA2基因及编码蛋白进行生物信息学分析。利用NCBI的BLASTx和ORF Finder分析cDNA序列；用InterProScan、PROSITE和PROSITE SCAN分析2个基因编码蛋白质的结构域和基元；用Protparam和SOPMA分析蛋白质理化性质和二级结构；用SignalP 4.0和TMHMM预测信号肽和跨膜区域；用Plant-mPLoc进行亚细胞定位分析。利用DNASTAR 7.0对氨基酸序列进行比对分析；借助MEGA 7.0构建进化树。

1.5 实时荧光定量PCR分析

2 结果与分析

2.1 基因克隆

经过2轮RACE反应，DoPMA15′-RACE、DoPMA13′-RACE和DoPMA23′-RACE的第2次PCR，分别获得预期长度的目标条带(图1)，经克隆、测序分别产生长1 801 bp 、1 586 bp、1 303 bp的3条序列，分别与EST原始序列拼接，获得2条cDNA序列，分别为3 366 bp和3 374 bp。BLASTx分析显示二者与GenBank中已注册植物质膜ATPases家族成员有较高的一致性(>76%)，因此，分别定名为DoPMA1和DoPMA2，提交GenBank获得注册号为KU160470和KU160471。DoPMA1的开放阅读框ORF(open reading frame)长2 922 bp，5′-UTR 181 bp，3′-UTR 263 bp；DoPMA2ORF长2 856 bp，5′-UTR 198 bp且具有uORF(13～93 bp)，3′-UTR 320 bp。2个基因cDNAs末端均含有真核生物特有的polyA结构，起始密码子附近碱基序列AAGATGG和AAAATGG遵循KOZAK规则，即A/GNNATGG[13]。BLASTn分析还显示DoPMA1和DoPMA2全长cDNAs与铁皮石斛基因组Predicted H+-ATPase(LOC110100541、LOC110111407)[14]相似度达到99%，进一步说明RACE获得2个基因全长的可靠性(图1)。

M.DL 2000; 1.DoPMA1-5′ RACE;2.DoPMA1-3′RACE;3.DoPMA2-3′RACE

图1DoPMA1和DoPMA2基因RACE扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of full lengthDoPMA1andDoPMA2RACE amplicons

2.2 组织表达特异性分析

分别提取铁皮石斛根、茎、叶样品的总RNA，利用qPCR技术检测2个基因的组织表达模式。图2结果表明，DoPMA1和DoPMA2基因在3种组织中的相对表达量存在差异，分别在茎中、叶中表达量最高。以叶为校正样本，DoPMA1在茎中的相对表达量为叶中的2.98倍，根中次之，为其1.95倍，叶中最低；DoPMA2在根中的相对表达量为叶中的0.86倍，茎中最低，为叶中的0.65倍。

2.3 蛋白理化特性分析

PROTPARAM预测DoPMA1和DoPMA2基因编码蛋白质的分子式分别为C4821H7685N1289O1392S34和C4731H7542N1254O1360S33，包含973和951个氨基酸残基，分子质量107.06 ku和 104.78 ku，等电点6.30和6.11。蛋白正电残基(Arg+Lys)为107和104，负电残基(Asp+Glu)为114和112，不稳定系数为38.12和 35.03，脂肪系数为102.81和102.80，亲水性系数为0.065和0.095。SOPMA分析表明， DoPMA1和DoPMA2蛋白质的二级结构主要由α螺旋(alpha helix, 48.61%和50.47%)、延伸链(extended strand, 15.01%和14.83%)、随机卷曲(random coil, 31.35%和29.76%)及少量的β转角(beta turn, 5.04%和4.49%)组成。

2.4 蛋白结构特征分析

InterProScan分析表明， DoPMA1与DoPMA2蛋白均含有2个保守的P型ATPase结构域、5个H+转运ATPase基序、1个E1-E2 ATPase磷酸化位点(表2)。PROSITE Scan分析表明，2个蛋白均含有一定数目的酰胺化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶C的磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点和N-糖基化位点(表2)。

SignalP 4.0分析表明,2个蛋白均无信号肽序列，不隶属分泌蛋白。TMHMM分析 DoPMA1蛋白存在8个跨膜域(68～90, 105～124, 252～274, 289～311, 657～679, 721～743, 808～830, 840～973)，DoPMA2蛋白存在10个跨膜域(66～88, 98～120, 242～264, 279～301, 641～669, 673～690, 711～733, 755～774, 787～809, 819～836)。Plant-mPLoc预测2个蛋白都定位在质膜。

图2 qPCR分析 DoPAM1和 DoPAM2基因的组织表达Fig.2 Tissue-specific expressions of DoPMA1 and DoPMA2 genes using qPCR analyses

结构域和基序Domains and motifs氨基酸位点Amino acid sites DoPMA1 DoPMA2P型ATPase结构域P-ATPase domain111～359,573～677101～350,563～676H+-转运ATPase基序H+-transporting ATPase motif455～473,570～586,598～614,629～654,783～804445～463,560～576,588～604,619～644,760～781E1-E2 ATPase磷酸化位点E1-E2 ATPase phosphorylation site341～347331～337酪氨酸激酶磷酸化位点Tyrosine kinase phosphorylation site202～209386～392cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点cAMP and cGMP-dependent phosphoryla-tion sites of protein kinases324～327314～317酰胺化位点Amidation site278～281,533～536523～526酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点Phosphorylation sites of casein kinase Ⅱ4～7,40～43,122～125,284～287,327～330,378～381,422～425,449～452,626～629,803～806,922～9258～11,39～42,112～115,143～146,193～196,317～320,356～359,368～371,412～415,447～450,616～619,751～754,854～857,864～867,901～904蛋白激酶C的磷酸化位点Phosphorylation sites of protein kinase C167～169,213～215,241～243,313～314,323～325,340～342,415～417,508～510,518～520,533～535,646～648,665～667,871～873,918～920,947～949157～159,203～205,303～305,313～315,330～332,498～500,523～525,636～638,655～657,705～707,740～742,747～749,848～850,863～865,864～866,897～899, 901～903, 926～928N-肉豆蔻酰化位点N-Nutmeg acylation site130～135,296～301,388～393,480～485,538～543,614～619,697～702,725～730,729～734,775～780,839～844,865～870,909～914,960～965120～125,286～291,470～475,528～533,604～609,687～692,715～720,719～724, 816～821N-糖基化位点N-glycosylation site118～121,447～450,656～659,717～72014～17,108～111,646～649

2.5 蛋白多序列比对和进化树构建

运用DNAStar 7.0的MegAlign对DoPMA1、DoPMA2与多种植物H+-ATPase蛋白序列比对分析。图3结果表明，DoPMA1与小兰屿蝴蝶兰PePMA1(XP_020577941)、水稻OSA8(AJ440219)、烟草NpPMA4(Q03194)、玉米ZmPMA2(NP_001292777)、水稻OSA7(AJ440218)和拟南芥AHA2(P19456)等蛋白的相似性分别为92.8%、73.0%、72.8%、72.7%、72.7%。DoPMA2与NpPMA4、ZmPMA2、OSA7、AHA2、OSA8、PePMA1的相似性分别为86.3%、86.1%、85.2%、84.1%、74.1%、72.6%。DoPMA1与DoPMA2相似性为73.4%，都具有2个高度保守的P型ATP酶结构域，符合其家族结构特点。

采用MEGA 7.0邻接法(Neighbour-Joining)构建DoPAM1、DoPAM2编码蛋白与拟南芥(11个)、水稻(10个)、烟草(6个)、玉米(16个)、苔藓(6个)、酵母(2个)和穴兔Oryctolaguscuniculus(1个)等物种共54个H+-ATPases蛋白的分子进化树。图4结果表明，以穴兔P2型(非P3型)ATPase SERCA2a为外类群，酿酒酵母SaccharomycescerevisiaePma1、裂殖酵母SchizosaccharomycespombeSchop1蛋白单独聚为一支，其他植物H+-ATPases聚为一大支。植物H+-ATPases又可聚为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 5大分支，DoPMA1与AHA1、NpPMA4、OSA7等H+-ATPases聚在Ⅴ支，DoPMA2与OSA8、AHA7、MHA7等聚在Ⅱ支，这与植物质膜H+-ATPases家族分子进化一致[3]。

实线和虚线分别为DoPMA1和DoPMA2的ATPase结构域；方框为磷酸化位点 Full lines and dot line indicates the P-type ATPase domains of DoPMA1 and DoPMA2, respectively; the box shows the phosphorylation site;A.拟南芥Arabidopsisthaliana；Do.铁皮石斛Dendrobiumofficinale；Np.烟草Nicotianaplumbaginifolia；Os.水稻Oryzasativa；Pe.小兰屿蝴蝶兰Phalaenopsisequestris；Zm.玉米Zeamays

图3 DoPMA1和DoPMA2蛋白与不同植物PMAs蛋白序列比对
Fig.3 Sequence alignments of DoPMA1 and DoPMA2 with PMAs proteins from other plants

A .拟南芥Arabidopsisthaliana；Do.铁皮石斛Dendrobiumofficinale；M.玉米Zeamays；Mp.地钱Marchantiapolymorpha；Np.烟草Nicotianaplumbaginifolia；Os.水稻Oryzasativa；Pma1、Schpo1.酿酒酵母、裂殖酵母 H+-ATPase Pma1, Schpo1 - fromSaccharomycescerevisiaeandS.pombeH+-ATPase；SERCA2a.穴兔P2型(非P3型)ATPaseOryctolaguscuniculusP2 type (non-P3 type) ATPase

图4 DoPMA1和DoPMA2与植物H+-ATPase蛋白家族进化树
Fig.4 Phylogenetic tree of DoPMA1 and DoPMA2 with H+-ATPases from various plants

3 讨 论

质膜H+-ATPase作为植物细胞主宰酶，自1972年首次在胡萝卜悬浮细胞原生质体中发现[1]后，其基因鉴定、基因表达、蛋白结构与活性及生物学功能等方面有大量报道。目前，质膜H+-ATPase基因家族在拟南芥[4-5]、烟草[6]、棉花[15]等植物中分离与鉴定，研究揭示它们参与调控植物体生长发育、次生代谢及逆境适应等众多生理过程。本试验利用RACE从铁皮石斛中分离出DoPMA1和DoPMA2cDNA全长，BLASTX分析其与GenBank中已注册植物PMA基因同源性较高，均高于76%；编码蛋白具有H+-ATPase家族保守的P型ATPase结构域及磷酸化位点，分别有8和10个跨膜域，介于植物P型H+-ATPase跨膜域8～12之间[1]；2个蛋白不含信号肽且预测定位在质膜，佐证了其为质膜蛋白，并具有转运特殊的分子、离子及信号传递等作用；进化树分析2个基因分别隶属于Ⅴ、Ⅱ分支，与已报道的植物H+-ATPase分子进化关系一致[16]。这些结果说明成功分离到了铁皮石斛DoPMA1和DoPMA2，且均属于P型H+-ATPase编码基因。

多家族成员以及高度同源性决定了H+-ATPases家族基因表达的多样性以及功能特异性，这与其植物生理代谢各过程密切相关。大量研究报道了植物H+-ATPases基因的表达特征。棉花中GhAH1,2,4-8在雄蕊中表达，而GhAH14，15在茎中表达，且不同发育阶段P型H+-ATPase酶的表达模式也有不同[15]。烟草PMA6在参与分泌的叶短毛头部以及发育中的叶和腋花茎与茎相连的皮质薄壁组织中表达，PMA9基因主要在不定根和腋芽的顶端分生组织以及茎的韧皮组织表达[17]。番茄LhA1-7在各器官中特异性表达，LhA8在正常培养、矿物质缺乏或高盐胁迫下几乎都不表达，而在被真菌浸染的菌根中高量表达[18]。本试验利用qPCR对石斛PMA基因进行组织表达模式检测，结果表明，DoPMA1基因在茎中表达量最高，而DoPMA2在叶中表达量最高，二者在石斛不同部位差异表达，说明DoPMA1、DoPMA2通过不同的表达调控方式参与了铁皮石斛的生长发育和形态建成。

系统发育分析显示拟南芥、烟草、水稻等植物54个质膜H+-ATPase基因聚为5个亚类。Ⅰ和Ⅱ分支基因在植物中高度表达，而其他3个分支基因在植物正常生长条件下表达量低或在特定细胞类型中表达[16]。烟草NpPMA4属于Ⅱ分支，在许多细胞类型中均有表达，尤其在根毛、表皮和保卫细胞，参与矿质营养，韧皮部负荷和气孔调控等生理过程[19]。在低pH条件下，水稻OSA1、OSA3、OSA7、OSA8和OSA9表达增强，导致H+-ATPase浓度增加以调控是水稻根系适应低pH[20]。在低磷胁迫下，拟南芥P型H+-ATPase基因AHA7介导根毛区细胞H+外流在根毛形成过程中发挥重要作用，AHA2主要调控根初生伸长生长[5]。本研究分子系统进化揭示DoPMA1与AHA1、NpPMA4、OSA7等H+-ATPases聚在Ⅴ支，DoPMA2与OSA8、AHA7、MHA7等H+-ATPases聚在Ⅱ支，据此推测DoPMA1和DoPMA2可能参与铁皮石斛的生长发育及抗逆生理。研究还证实H+-ATPase基因的表达调控与菌根共生关系密切[8,21]。蒺藜苜蓿MedicagotruncatulaP型H+-ATPase基因MHA1受菌根真菌侵染诱导且在丛枝中特异表达，MHA2、MHA3则组成型表达[21]。DoPMA1和DoPMA2基因片段分离自铁皮石斛种子共生萌发cDNA文库[11]，说明这2个基因可能参与调控石斛种子共生萌发。总之，其具体的功能与作用机制还需要进一步研究。