MTBDRplus技术快速检测结核分枝杆菌耐多药的临床应用评价

耐药结核病的发生和流行成为结核病控制的重要障碍和急待解决的世界性严重公共卫生问题。2007年全国结核病耐药性基线调查报告显示，我国肺结核的耐多药率为8.32%，据此估计，我国耐多药结核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)患者达12万例，约占全球1/4～1/3，居全球第2位[1]。传统的结核病药敏检测方法至少需要2～3月的时间，远不能满足临床早期诊断的需要，早期耐药性诊断技术的突破是当前控制耐药结核病的关键。

1 材料与方法

1.1材料 本研究共调查了2010-2016年福州市各区县疾控中心收治的262例涂阳肺结核患者，分离培养出262株分枝杆菌，经传统PNB和TCH生长试验鉴定246株为结核分枝杆菌，16株为非结核分枝杆菌(NTM)。标准菌株H37 RV由国家参比室惠赠。

1.2培养、菌种鉴定和耐药检测方法 按照《结核病诊断实验室检验规程》[5]规定进行分枝杆菌分离培养、菌种初步鉴定，采用WHO/IUATLD《结核病耐药监测指南》[6]推荐的比例法对INH和RIF进行耐药检测。

1.3 MTBDRplus技术检测

1.3.1提取DNA 取1～2个菌落悬于300 μL无菌水中，振荡混匀， 95 ℃加热灭活20 min，超声波裂解15 min。12 000 g离心5 min，取5 μL上清液作为DNA模板用于PCR扩增。

1.3.2扩增 扩增程序为：95 ℃ 15 min，1个循环；95 ℃ 30 s、58 ℃ 2 min，10个循环；95 ℃ 25 s、53 ℃ 40 s、 70 ℃ 40 s，30个循环；70 ℃ 8 min，1个循环。

1.3.3杂交 根据Geno Type MTBDRplus assay试剂盒说明书进行操作。将PCR扩增产物和变性裂解液DEN 20 μL混匀加入杂交反应板，孵育5 min。在全自动杂交仪GT-BLOT48上根据厂家设定的步骤进行操作。杂交后，将试纸条取出置于吸水纸上干燥，然后粘贴在判读表上。

1.3.4判读 MTBDRplus杂交试纸条可分为4个区，27个反应条带(见图1)。第1区为对照质控带，有3个质控带，分别是CC带，AC带和TUB带。CC带(标记物质控)反映探针试条上标记物结合并与定位反应的有效性，AC带(扩增质控)用于确认PCR扩增反应是否成功，TUB带用于确认结核分枝杆菌复合群；第2-4区为耐药基因探针区：第2区是与RIF耐药相关的rpoB基因探针组，第3、4区分别是与INH耐药相关的katG和inhA基因探针组。判读时，试纸条上所有野生条带显色不显色为敏感菌株；野生条带有缺失，突变条带无论是否显色均判为耐药。

1.3.5统计分析 应用SPSS16.0软件进行数据处理，对两种方法在结核分枝杆菌耐药检测中的比较采用配对四格表资料的卡方检验，P<0.05差异有统计学意义。采用Kappa值对两种方法检测结果一致性进行评价(Kappa值≥0.75为一致性较好，Kappa值在0.4～0.75为一致性一般，Kappa值≤0.4时为一致性差)，利用阳性预测值和阴性预测值对检测方法应用价值进行评价。

2 结 果

2.1MTBDRplus技术检测NTM和结核分枝杆菌菌株结果 246株结核分枝杆菌TUB条带均显阳性，表明是结核分枝杆菌复合群(见图1编号2-13和15的试纸条)，与PNB和TCH生长试验鉴定结果100%符合；16株非结核分枝杆菌TUB条带缺失，表明未检出结核分枝杆菌复合群(见图1编号14的试纸条)，与PNB和TCH生长试验鉴定结果100%符合。利用MTBDRplus 技术可以很好的区分NTM和结核分枝杆菌。

注：N，阴性对照；1，结核分枝杆菌H37Rv；2-15，分枝杆菌临床分离株。图1 GenoType MTBDRplus 技术杂交结果Fig.1 Hybridization assay results of GenoType MTBDRplus

2.2MTBDRplus技术检测RIF和INH耐药性结果 在本次研究中，利用传统罗氏药敏技术检测246株结核分枝杆菌，单耐RIF的菌株共计12株，单耐INH的菌株共计18株，耐多药菌株共计8株，全敏感菌株共计224株。

以传统罗氏药敏为金标准，MTBDRplus检测RIF耐药性的灵敏度和特异度分别为91.7%和99.6%，阳性预测值和阴性预测值分别为91.7%和99.6%，如表1所示。传统罗氏药敏方法和MTBDRplus技术检测RIF的耐药率均为4.9%，在福州地区用这两种方法检测RIF耐药比较差异无统计学意义(χ2=0.500，P=0.48>0.05)，两种方法结果一致性较好(Kappa=0.912)。

以传统罗氏药敏为金标准，MTBDRplus检测INH耐药性的灵敏度和特异度分别为83.3%和95.2%，阳性预测值和阴性预测值分别为57.7%和98.6%，见表1。传统罗氏药敏方法检测INH的耐药率为7.3%，MTBDRplus技术检测INH耐药率为10.6%，在福州地区用这两种方法检测INH耐药比较差异无统计学意义(χ2=3.500，P=0.061>0.05)，两种方法结果一致性一般(Kappa=0.652)。

表1 MTBDRplus检测结果与罗氏药敏结果比较
Tab.1 Comparison the results of MTBDRplus test with those of Lwenstein-Jensen culture plus drug susceptibility

罗氏药敏结果MTBDRplus结果RIFINH耐药敏感耐药敏感耐药1111511敏感12333217合计1223418228

2.3MTBDRplus技术检测结核分枝杆菌临床分离株katG和inhA基因突变 以传统罗氏药敏为金标准，MTBDRplus技术检测INHkatG耐药基因突变灵敏度和特异度分别为77.8%和99.6%，阳性预测值和阴性预测值分别为93.3%和98.3%，见表2。传统罗氏药敏方法检测INH的耐药率为7.3%，MTBDRplus技术检测katG耐药基因突变率为10.6%，在福州地区用这两种方法检测INH耐药比较差异无统计学意义(χ2=0.800，P=0.371>0.05)，两种方法结果一致性较好(Kappa=0.838)。

以传统罗氏药敏为金标准，MTBDRplus技术检测INHinhA耐药基因突变灵敏度和特异度分别11.1%和95.6%，阳性预测值和阴性预测值分别为16.7%和93.2%，见表2。传统罗氏药敏方法检测INH的耐药率为7.3%，MTBDRplus技术检测inhA耐药基因突变率为4.9%。在福州地区用这两种方法检测INH耐药比较差异无统计学意义(χ2=0.962，P=0.327>0.05)，两种方法诊断结果一致性较差(Kappa=0.079)。

表2 MTBDRplus检测katG和inhA基因突变引起耐药与罗氏药敏结果比较
Tab.2 Comparison the MTBDRplus detection results ofkatGandinhAgene mutation caused drug resistance with those of Lwenstein-Jensen culture plus drug sensitivity

罗氏药敏结果MTBDRplus结果katGinhA耐药敏感耐药敏感耐药141210敏感422716218合计1822818228

2.4MTBDRplus技术检测rpoB基因突变区域分布情况 在12例rpoB基因存在突变的结核分枝杆菌中，7例(58.3%)存在rpoB基因S531L突变，其中1例(8.3%)rpoB基因野生型WT2和WT7同时缺失，提示存在rpoB基因511和526两个位点突变；1例(8.3%)rpoB基因野生型WT3和WT4同时缺失，提示存在D516Y或515缺失；各有1例(8.3%)存在rpoB基因526位点突变、531位点突变和H526D突变，见表3。在6例耐多药结核分枝杆菌中，3例(50%)存在rpoB基因S531L突变。

表3 MTBDRplus技术检测rpoB基因突变区域分布
Tab.3 Detection of mutation site distribution inrpoBgene by MTBDRplus

MTBDRplus 检测分析菌株数rpoB突变位点结果(%)△WT2 △WT7511和526突变RIFr1(8.3)△WT8 MUT3S531LRIFr6(50)RIFs1(8.3)△WT7526突变RIFr1(8.3)△WT3 △WT4D516Y或515缺失RIFr1(8.3)△WT8531突变RIFr1(8.3)△WT7 MUT2BH526DRIFr1(8.3)合计RIFr /RIFs12

注：WT是野生探针；MUT是突变探针；RIFr是利福平耐药；RIFs是利福平敏感；△是缺失。

2.5MTBDRplus技术检测katG和inhA基因突变区域分布情况 26例katG和inhA基因存在突变的结核分枝杆菌中， 57.7%(15/26)存在katG基因315突变，这些315位点突变菌种93.3%(14/15)均为INH耐药菌株；42.3%(11/26)菌种存在inhA基因C15T位点突变，这些C15T位点突变菌株仅9.1%(1/11)为INH耐药菌株；有1例菌株同时存在katG和inhA基因突变，见表4。

表4 MTBDRplus技术检测katG和inhA基因突变区域分布
Tab.4 Detection of mutation site distribution ofkatGandinhAby MTBDRplus

MTBDRplus 检测分析菌株数katGinhA突变位点结果(%)△WT mut1WTS315T1INHr10(38.5)mut1WTS315T1INHr2(7.7)mut1mut3AS315T1 T8CINHr1(3.8)△WTWTS315TINHs1(3.8)△WT mut2WTS315T2INHr1(3.8)WT△WT1 mut1C15TINHs10(38.5)WT△WT1 mut1C15TINHr1(3.8)合计INHr /INHs26

注：WT是野生探针；mut是突变探针；INHr是异烟肼耐药；INHs是异烟肼敏感；△是缺失

3 讨 论

结核病是我国政策规定的重大传染病之一，由于药物的不恰当使用耐药结核病患病率急剧上升，而耐药结核分枝杆菌的实验室快速检测方法的使用对控制耐药结核病的传播具有重要意义。MTBDRplus技术是近年来发展起来基于PCR扩增和杂交的方法，用于检测特定基因的碱基突变，从而诊断结核分枝杆菌的耐药性。其检测相比培养表型分析具有明显的时间优势，可同时完成对RIF和INH耐药性的快速检测，操作简单，结果清晰可见[7]。但是，MTBDRplus技术在不同地区对RIF和INH耐药检测敏感度不同，尤其是对耐INH菌株的灵敏度差异较大[4]。

北京和上海地区已经对MTBDRplus技术进行了评价，其对RIF和INH的敏感性分别为80.65%～98.0%和72.73%～86.5%[2-3,7]。国际上也有一些研究对MTBDRplus技术进行临床使用的评价。Causse[8]的研究结果显示，与传统的罗氏药敏方法相比，MTBDRplus技术检测RIF和INH的敏感度分别达100%和94.59%。可见，在不同国家和地区使用MTBDRplus技术检测耐多药结核分枝杆菌差异较大，这可能是由于耐药基因突变位点因国家和地区而异[9-10]。因此，在某个地区使用MTBDRplus技术进行临床检测耐多药结核分枝杆菌前很有必要进行临床应用评估。

本研究利用MTBDRplus技术快速检测246例临床涂阳肺结核分离株对RIF和INH的耐药性。与传统罗氏药敏结果比较，MTBDRplus技术检测RIF和INH的特异度均超过90%，敏感度分别为91.7%和83.3%。说明利用该技术在福州地区快速检测耐多药结核分枝杆菌有较好的适用性。

本次研究还发现，福州地区耐RIF结核分枝杆菌中，rpoB基因S531L位点突变最频繁(58.3%)，该突变特征与福建省MDR菌株rpoB基因的突变特征报道相符[11]。而Paolo Mitto的研究表明rpoB基因突变最频繁的是D516L(43.8%), S531L的突变率则为9.4%[12]。这种差异可能与不同地区流行菌株差异有关。本研究中，6例耐多药MTB中，50%也存在rpoB基因S531L突变。因此在实验结果分析时要特别注意S531L位点突变。

本研究显示katG基因突变以315位点突变为主，inhA基因突变以C15T位点突变为主。在所有INH突变株中，315位点突变率(57.7%)低于福建省MDR菌株katG基因的突变特征(73.42%)报道[11]。而inhA基因C15T位点突变率(42.3%)比福建省(11.39%)和北京地区(21.6%)均高出许多[11,13]。这些存在C15T位点突变菌株仅一株为INH耐药菌株，与传统药敏试验相比，检测inhA耐药基因的Kappa值仅为0.079，建议谨慎判断inhA基因C15T位点突变引起的INH耐药。

本试验结果说明福州地区INH耐药结核菌株多与katG耐药基因突变有关。本研究中我们发现，在246株结核分枝杆菌中有3株INH耐药株用MTBDRplus技术未检出katG和inhA耐药突变。说明除了katG和inhA耐药基因外可能还有其它基因突变引起INH耐药突变，如kasA、ahpC及oxyR基因[14]。MTBDRplus技术敏感性高，特异性强，但也存在一定的局限性[1]。如对检测INH是否耐药仅对最常见的katG和inhA2个基因进行检测，而未对耐药基因突变有关的其它基因进行检测，故其敏感度和特异度相较于RIF耐药检测偏低。另外，除突变引起耐药外，分枝杆菌存在药物主动外排泵的表达，也可能与INH耐药相关[15-16]。

福州属于南方沿海城市，NTM引起的肺病相对内陆地区更为严重，福建省NTM临床分离率占分枝杆菌培养阳性株的10.2%[17]。本研究利用MTBDRplus技术区分结核分枝杆菌与NTM的敏感度和特异度均为100%。因此，利用MTBDRplus技术对NTM肺病与结核病进行筛查，对NTM肺病与结核病的鉴别诊断和治疗有重要意义。

总之， MTBDRplus技术快速、灵敏度高，特异性好，能早期发现耐药，尤其是耐多药病人。对于耐药病人而言，尽早实施个体化治疗方案对于病人的规范治疗和早期治愈提供保障，从公共卫生角度而言，早期发现耐药病人可有效发现并控制传染源，阻断耐药结核病的传播。