丹酚酸B抑制肝纤维化-肝癌小鼠进展的信号通路研究

2019-07-16 08:30林雪茹王福祥

肝脏 2019年6期

林雪茹王福祥

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是起源于肝脏上皮或间叶组织的恶性肿瘤[1]，通常由慢性肝炎进展为肝纤维化(hepatic fibrosis)，再由肝纤维化进展为肝硬化(hepatocirrhosis)，最终演变成HCC。现代研究已将中药治疗确定为HCC防治的重要研究方向之一[2]。近年来，丹参广泛以应用于肝炎、肝硬化、HCC等肝病治疗中，其有效水溶性成分丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)可有效抑制肝纤维化进展[3-4]，阻碍HCC发生。然而，丹酚酸B抑制肝纤维化-肝癌小鼠进展的相关机制尚不清楚。基于此，本研究在二乙基亚硝胺诱导下建立肝纤维化-肝癌小鼠模型[5]，旨在探讨Sal B对肝纤维化-肝癌小鼠的调控机制。

资料与方法

一、实验动物

KM小鼠45只，SPF级，雄性，周龄6～8周，体质量为(18±22) g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可为SCXK(沪)2017-0005。

二、实验方法

将小鼠随机分为对照组、模型组、Sal B组，各组15只，适应性喂养1周后，模型组和Sal B组腹腔注射10 mL/kg 1.0%二乙基亚硝胺溶液(北京偶合科技有限公司)诱导肝纤维化-肝癌模型，对照组腹腔注射等量生理盐水(广州市益满生物科技有限公司)，1次/周，连续16周。于造模当天开始，Sal B组给予20 mL/kg·d-1Sal B灌胃，对照组给予等量生理盐水灌胃，持续灌胃至16周末。于肝纤维化期(12周末)处死小鼠4只，肝癌癌前病变期(16周末)处死小鼠5只，摘取肝组织备用，评价以下指标：①小鼠肝纤维化期和肝癌前阶段的一般情况：包括精神状态、毛发、饮食、活动、死亡率等。②小鼠肝纤维化期和肝癌前阶段的肝脏指数：肝脏指数=(肝脏重量/体质量) ×100%。③肝组织情况：采用4%多聚甲醛溶液(上海江莱生物科技有限公司)固定肝组织，脱水，包埋，切为4 μm薄片，烤片，脱蜡，脱苯，冲洗，苏木精-伊红(HE)染色，梯度酒精(武汉梯度科技有限公司)脱水，二甲苯(深圳市吉达安科技有限公司)透明，中性树脂(山东圣马生物科技有限公司)封片，显微镜下观察肝组织形态。④采用Western Blot法检测各组肝组织中pSmad3C、21、pSmad3L、pPAI-1蛋白表达：取小鼠肝组织，加RIPA裂解液，混匀，离心，提取总蛋白，上样，电泳，转至PVDF膜(Bio-Rad公司)上，25℃封闭1 h，加入兔抗PAI-1多克隆抗体、兔抗pSmad3C单克隆抗体(上海佑隆生物科技有限公司)、兔抗pSmad3L多克隆抗体(成都普思生物科技股份有限公司)、兔抗p21单克隆抗体(上海亿欣生物科技有限公司)、兔抗GAPDH单克隆抗体(Abcam公司)，4℃孵育过夜，洗膜，加山羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)室温孵育90 min，PBST洗膜，曝光显影，以GAPDH为内参蛋白，采用Image Quant TL软件分析各条条带的灰度值。

三、统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析比较组间计量资料(体质量、肝脏重量、肝脏指数)，P<0.05表示有统计学差异。

结果

一、各组小鼠一般情况

对照组小鼠精神状态良好，背毛柔顺有光泽，饮食、活动、反应均正常，无一例死亡。模型组小鼠在肝纤维化期时精神较差、毛发光泽度差、饮食基本正常，活动量较少，处于肝癌癌前病变期时的小鼠精神萎靡、皮毛枯槁无光泽、饮食明显异常，活动量明显减少，捕捉无抵抗，死亡小鼠数为小鼠死亡率为40%(6/15)。Sal B组较模型组精神、毛发、饮食、活动、反应等方面的表现均有明显改善，小鼠死亡率为20%(3/15)。

二、各组小鼠肝脏指数

肝纤维化期时，模型组及Sal B组肝脏指数较对照组显著降低(P<0.05)，模型组肝脏指数较Sal B组差别不大(P>0.05)；肝癌癌前病变期时，模型组及Sal B组肝脏指数较对照组显著降低(P<0.05)，Sal B组肝脏指数较模型组显著升高(P<0.05)(表1)。

三、各组小鼠肝组织形态

对照组肝组织形态完整，边缘锐利，色泽正常，表面光滑，质地柔软有弹性，光镜可见肝小叶结构完整，有汇管区，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，无变性坏死；肝纤维化期时，模型组肝组织表面粗糙，色泽异常，边缘变钝，光镜可见胞质分解边界模糊，肝细胞大量坏死，炎性细胞浸润，大量胶原纤维分隔肝小叶形成假小叶结构；Sal B组表面较光滑，色泽明显改善，质地较柔软不易破裂，光镜可见肝细胞坏死减少，炎细胞浸润减少。肝癌癌前病变期时，模型组肝组织表面粗糙，质地坚硬易破裂，出现大量弥漫性结节，光镜可见肝小叶结构紊乱，肝小叶内肝细胞大量坏死，肝细胞核体积变大，分裂相增多、异型性明显，染色变深，出现明显点状出血点，大量淋巴细胞浸润；Sal B组较模型组弥漫性结节变少，质地较柔软，光镜可见肝细胞坏死、炎细胞浸润等有明显改善(图1、图2)。

表1 各组小鼠肝脏指数比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

图1 肝纤维化期时，各组肝组织形态学图片及HE染色结果(×100)

图2 肝癌癌前病变期时，各组肝组织形态学图片及HE染色结果(×100)

四、各组小鼠肝组织中pSmad3C、p21、pSmad3L、PAI-1蛋白表达水平

模型组小鼠肝纤维化期时肝组织中p21、pSmad3L蛋白表达水平与对照组比较明显上调(P<0.05)；模型组小鼠肝纤维化期时肝组织中pSmad3C蛋白表达与对照组比较无明显变化(P>0.05)；Sal B组小鼠肝纤维化期时肝组织中pSmad3L、PAI-1蛋白表达水平与模型组比较明显下调；Sal B组小鼠肝纤维化期时肝组织中pSmad3C、p21蛋白表达水平与模型组比较明显上调(P<0.05)(图3)。

模型组小鼠肝癌癌前病变期时肝组织中pSmad3C、p21、pSmad3L、PAI-1蛋白表达水平与对照组相比明显上调(P<0.05)；Sal B组小鼠肝癌癌前病变期时肝组织中p21蛋白表达水平与模型组比较无明显变化(P>0.05)；Sal B组小鼠肝癌癌前病变期时肝组织中pSmad3L、PAI-1蛋白表达水平与模型组比较明显下调(P<0.05)；Sal B组小鼠肝癌癌前病变期时肝组织中pSmad3C蛋白表达水平与模型组比较明显上调(P<0.05)(图4)。

讨论

近年来，丹参及其复方制剂广泛应用于抗肝纤维化中，具有良好疗效，Sal B是其水溶性提取物之一。相关临床研究证实, Sal B可抑制肝星状细胞活化，减少胶原纤维(collagenous fiber)沉积，从而发挥抗肝纤维化作用[6]。有研究报道Sal B可抗血吸虫引发的肝纤维化，可下调血清中层黏连蛋白(laminin，LN)、IV型胶原(collegen type IV，C-IV)、总胆红素(Total bilirubin，TBil)水平，且对乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B)肝纤维化患者无明显毒副作用。另有文献显示[7]，Sal B可减轻CCl4、二乙基亚硝胺、TGF-β1等诱导的大鼠肝纤维化。二乙基亚硝胺是一种具有极强刺激气味的N-亚硝基类物质，其可经过慢性肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌过程诱导HCC发生。本实验采用二乙基亚硝胺诱导小鼠肝纤维化-肝脏癌前病变模型，结果显示模型小鼠精神状态、毛发生长、饮食活动等均异常，肝脏指数下降，小鼠死亡率上升；HE染色结果显示，模型小鼠肝组织表面粗糙，肝细胞变性，出现弥漫性结节，胶原纤维增生，炎细胞浸润，12周末出现假小叶结构，16周末增生肝细胞核异型性明显。而Sal B组小鼠在肝纤维化期及肝癌癌前病变期的一般情况、体质量、肝脏重量、肝组织形态及肝细胞坏死现象、炎性细胞浸润情况、细胞异型性等较模型组均有显著改善。提示Sal B可抑制二乙基亚硝胺诱导小鼠肝纤维化-肝癌进展，对小鼠肝纤维化和HCC癌前病变有防治作用。近年有文献报道[8]，TGF-β1 /Smad信号转导通路在HCC病情进展中发挥不同效应，目前认为这种效应与Smad3不同位点磷酸化有关，其L-末端活化形式pSmad3L，靶向下游基因PAI-1，介导促进肝纤维化-肝癌信号，而其C-末端活化形式pSmad3C，靶向下游基因p21，介导抑制肝纤维化-肝癌信号。因此，我们推测Sal B可能通过干预 pSmad3C/pSmad3L而发挥抗肝纤维化-肝癌作用。本研究结果显示，模型组p21、pSmad3L蛋白表达水平明显高于对照组，Sal B组pSmad3C、p21蛋白表达水平明显高于模型组，可能是Sal B通过TGF-β1/转化生长因子β受体I(transforming growth factor β receptor I，TβRI)通路上调pSmad3C表达，激活其靶向下游p21蛋白表达，进而抑制肝纤维化肝纤维化-肝癌进展。Sal B组pSmad3L、PAI-1蛋白表达水平明显低于模型组，分析其原因，Sal B可能通过TGF-β1/SAPK通路抑制pSmad3L表达，进而下调PAI-1表达，进而延缓肝纤维化-肝癌进展。