气相色谱内标法测定五福心脑清软胶囊中冰片含量

杨晓玲，郝 福，侯金才*

(1.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430；2.京津冀联创药物研究(北京)有限公司，北京100083)

五福心脑清软胶囊是以传统活血化瘀中药红花的果实中提取的精制红花油为主药，辅以芳香开窍的冰片及维生素E、维生素B6组成的以中药为主的中西药复合制剂，具有活血散瘀、通经止痛、开窍醒神之功效。临床用于瘀血阻滞所致的中风、中经络、半身不遂、口眼歪斜、胸痹心痛、脑梗死、冠心病、心绞痛及高血脂症见上述证候者[1-4]。收载于国家药品中药标准(经络肢体 脑系分册)，原标准只有冰片鉴别，本研究建立气相色谱法[5]测定五福心脑清软胶囊中冰片含量，并根据ICH等相关指导原则进行了方法学验证，结果该方法专属、精密、准确，可以作为五福心脑清软胶囊的质量控制方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

PE Clarus580气相色谱仪(铂金埃尔默)，DB-WAX柱(30 m×320 μm，0.50 μm；安捷伦)；MS-105DU型分析天平(梅特勒)；

1.2 试药

五福心脑清软胶囊(神威药业集团有限公司，批号为16090731、16090732、16090733)；龙脑对照品(食品药品检定研究院，批号110881-201508)；内标物：水杨酸甲酯(中国食品药品检定研究院，批号110707-201413)；异龙脑对照品(南通飞宇生物公司，批号FY-GA01)；冰片原料(四川青神康华制药有限公司，批号160308)；试剂：无水乙醇(色谱纯，天津赛孚瑞)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

DB-WAX柱(30 m×320 μm，0.50 μm)；载气为氮气；流速为1.5 mL·min-1；进样口温度为250 ℃；分流比10：1；起始柱温为130 ℃，保持11 min，以20 ℃·min-1的速度升温至220 ℃，保持30 min；采用FID检测器，温度为250 ℃；氢气流量45 mL·min-1，空气流量450 mL·min-1；进样体积为1 μL。

2.2 标准溶液制备

2.2.1 内标溶液 取水杨酸甲酯适量，精密称定，加无水乙醇制成每1 mL约含7.5 mg的溶液，作为内标溶液。

2.2.2 对照品溶液 取龙脑对照品10 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加无水乙醇适量使溶解，精密加入内标溶液2 mL，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为100%对照品溶液，保持内标溶液加入量不变，依法配制80%、120%对照品溶液[6]。

2.2.3 供试品溶液 取五福心脑清适量，倾出内容物，混匀，取约2.5 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加无水乙醇适量使溶解，精密加入内标溶液2 mL，用无水乙醇稀释至刻度，充分摇匀，作为供试品溶液。

2.2.4 阴性对照储备液 取精制红花油38 g，维生素E 1.64 g与维生素B62.0 g置同一密封容器中，超声混合均匀，备用。

2.2.5 异龙脑定位溶液 取异龙脑对照品约10 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为异龙脑定位溶液。

2.2.6 冰片原料溶液 取冰片原料约100 mg，精密称定，置20 mL量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为冰片原料溶液。

2.3 方法学验证[7-11]

2.3.1 系统适用性试验 在上述色谱条件下，精密吸取3个浓度的对照品溶液各1 μL，注入气相色谱仪，记录色谱图，每个浓度平行进样2次。结果平均校正因子为0.68，RSD=0.68%，系统适用性良好。

2.3.2 专属性试验 1倍阴性对照溶液：取阴性对照储备液约2.48 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，充分摇匀，即得；3倍阴性对照溶液：取阴性对照储备液约7.44 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，充分摇匀，即得；内标溶液：按“2.2.1”制备方法操作；对照品溶液：按“2.2.2”100%浓度制备方法操作；异龙脑溶液：按“2.2.5” 制备方法操作；冰片原料溶液：按“2.2.6” 制备方法操作；供试品溶液：按“2.2.3” 制备方法操作。精密吸取上述溶液各1 μL注入气相色谱仪，记录色谱，结果见图1。

图1 专属性试验图谱

续图1 专属性试验图谱

由图谱信息可知，在龙脑与水杨酸甲酯内标色谱峰位置处，不含冰片的阴性对照均无色谱峰出现。由此表明其他物质对测定无干扰，该方法专属性良好。

2.3.3 线性与范围试验 ①取龙脑对照品40 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为200%龙脑储备液；②取水杨酸甲酯120 mg，精密称定，置20 mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为内标储备液；③线性溶液的配制：分别精密量取200%对照品储备液5、8、15 mL分别置于3个20 mL量瓶中，分别精密加入内标储备液2 mL，用无水乙醇稀释至刻度摇匀，作为50%、80%、150%的线性溶液，分别精密量取200%对照品储备液5、6 mL分别置于2个10 mL量瓶中，分别精密加入内标储备液1 mL，用无水乙醇稀释至刻度摇匀，作为100%、120%的线性溶液。

精密吸取上述线性溶液各1 μL注入气相色谱仪，记录色谱图。以龙脑对照品的浓度为横坐标(x)，以龙脑对照品的峰面积与内标物的峰面积之比为纵坐标(y)，进行线性回归分析，得回归方程为：y=2.515 9x-0.009 5(r=0.999 9)，结果表明在0.19～0.58 mg· mL-1范围内有良好线性关系。

2.3.4 溶液稳定性试验 将对照品溶液与供试品溶液分别于0、4、8、12、18、24 h，精密吸取各1 μL注入气相色谱仪，记录色谱图。每个时间点与0小时的测定结果相比，相对平均偏差均<3.0%，表明对照品溶液和供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 精密度试验 甲乙两人分别各自配制6份供试品溶液在不同时间进行测定，结果12份供试品溶液RSD=0.64%(n=12)，精密度良好。

2.3.6 准确度试验 ①50%浓度溶液：取龙脑对照品10 mg，精密称定，与阴性对照储备液约4.96 g置同一50 mL量瓶中，加无水乙醇适量使溶解，精密加入内标溶液4 mL，用无水乙醇稀释至刻度，充分摇匀，作为50%浓度水平溶液；②100%浓度溶液：取龙脑对照品10 mg，精密称定，与阴性对照储备液约2.48 g置同一25 mL量瓶中，加无水乙醇适量使溶解，精密加入内标溶液2 mL，用无水乙醇稀释至刻度，充分摇匀，作为100%浓度水平溶液；③150%浓度溶液：取龙脑对照品15 mg，精密称定，与阴性对照储备液约2.48 g置同一25 mL量瓶中，加无水乙醇适量使溶解，精密加入内标溶液2 mL，用无水乙醇稀释至刻度，充分摇匀，作为150%浓度水平溶液。每个浓度水平平行配制3份。

精密吸取上述50%、100%、150%浓度溶液各1 μL注入气相色谱仪，记录色谱图。平均回收率为97.44%，RSD=0.64%，结果表明，本方法具有良好的回收率，结果见表1。

表1 回收率结果

2.3.7 耐用性试验 通过改变载气流速±0.1 mL/min，初始温度±5 ℃。结果表明，色谱条件作微小变动，测定结果基本不受影响，保持一致，表明该方法耐用性良好。

2.4 样品含量测定

按“2.2.3”方法制备3批供试品溶液后，进行测定，用内标法计算，结果见表2。

表2 样品分析结果

3 讨论

3.1 冰片含量测定依据

根据国内复方中药的质量标准制定指导原则[12]，处方中如果含有挥发性成分，如冰片、樟脑、挥发油时，应对易挥发性成分进行含量测定，规定含量范围。控制易挥发性成分的含量，有利于控制制剂质量，保证制剂的疗效。

冰片对照品是人工合成的，由龙脑和异龙脑组成。在本试验条件下，五福心脑清软胶囊的色谱峰中冰片也是两个峰，通过比较保留时间，可以确定为龙脑和异龙脑，因此该药中冰片为合成冰片[13-14]，最终我们建立了本品种冰片含量测定方法，以龙脑成分来计。

3.2 样品溶剂确定

统计药典[15]收载冰片测定品种所用溶剂，有环己烷、三氯甲烷、石油醚、无水乙醇、乙酸乙酯等，不统一。基于绿色环保检测方法的考虑，我们选择用无水乙醇作为溶剂。从测定结果可以看出，无水乙醇可以完全溶解五福心脑清软胶囊内容物，准确性良好。

3.3 内标物选择

经相关药典[15]品种的查阅发现，测定冰片方法均为气相色谱法，采用的定量方法基本为内标法。一般而言，内标法可以避免系统带来的误差，相对外标法更为准确，所以本品冰片的检测方法定为内标法。

内标物的合适性尤其关键，内标物选择的一般原则：内标物应与待测物分子结构相近，在色谱图中内标物在待测物附近出峰；样品中不存在内标物，且内标物与待测物分离完全；内标物应是纯物质；内标物与样品互溶，且不发生化学反应[16]。

在色谱图中水杨酸甲酯在龙脑附近出峰；通过专属性试验可知，样品中不存在内标物，且水杨酸甲酯与龙脑分离完全；水杨酸甲酯稳定，标准品易得；水杨酸甲酯与样品互溶。水杨酸甲酯作为内标物，稳定性较好，不受其他因素的影响，校正因子结果均维持在精确的范围内(0.68±0.01)，所以选择其为内标物结果准确可靠。

3.4 色谱方法确定

①色谱柱选择：统计药典[15]收载冰片测定品种发现，色谱柱为毛细管色谱柱，类型均为聚乙二醇20000(PEG-20M)，我们最终选择了DB-WAX柱(30 m×320 μm，0.50 μm)，该色谱柱具有高效性，分离效果好。②柱温的选择[17]：冰片中含有龙脑和异龙脑两种同分异构体成分，二者性质相似，本实验以龙脑为特征峰，对洗脱条件进行了优化(加入了升温程序)，结果在最佳色谱条件下，既保证了龙脑峰与异龙脑峰有较好的分离度，又保证龙脑和内标峰有较好的峰型和适宜的保留时间，排除了复方中其他成分及基质对于冰片中龙脑含量测定结果的干扰，最终采用程序升温法。

综上所述，本试验中采用气相色谱法测定五福心脑清软胶囊中冰片含量，经方法学研究显示，该方法专属、准确，可用于本品含量测定，为该药品提供了有效的质量控制方法。