不同浓度己酮可可碱对精子功能的影响研究

张慧娜　王丽媛　习海涛

[摘要] 目的 探讨不同浓度己酮可可碱对精子功能的影响。 方法 选择37例弱精患者的精液标本作为研究对象。所有研究对象均禁欲3～7 d后，采用手淫法取得全份新鲜精液标本，用计算机辅助精子分析（CASA）检测精子各项参数。加入己酮可可碱使其终浓度分别为0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.6 mmol/L、1.0 mmol/L、3.0 mmol/L、5.0 mmol/L，检测精子活力和活率及运动功能[包括精子直线速度（VSL）和曲线速度（VCL）]。 结果 与0.1 mmol/L组比较，其余各组不同時间精子活力、精子活率、VSL和VCL均增加（P<0.05）;与0.3 mmol/L组比较，0.6 mmol/L组、1.0 mmol/L组、3.0 mmol/L组和5.0 mmol/L组精子活力、精子活率、VSL和VCL增加（P<0.05）;与0.6 mmol/L组比较，1.0 mmol/L组、3.0 mmol/L组和5.0 mmol/L组精子活力、精子活率、VSL和VCL增加（P<0.05）;1.0 mmol/L组精子活力、精子活率、VSL和VCL高于3.0 mmol/L组和5.0 mmol/L组（P<0.05）;与10 min比较，除0.1 mmol/L组外，其余各组浓度在30 min、60 min和120 min精子活力、精子活率、VSL和VCL增加（P<0.05）;与30 min比较，除0.1 mmol/L组外，其余各组浓度在60 min精子活力、精子活率、VSL和VCL增加（P<0.05）。 结论 己酮可可碱浓度1.0 mmol/L孵育60 min对精子功能效果最好，精子活力、精子活率及精子运动功能最佳。

[关键词] 己酮可可碱;精子活力;精子活率;精子运动功能

[中图分类号] R698.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）15-0035-04

Effect of different concentrations of pentoxifylline on sperm function

ZHANG Huina   WANG Liyuan   XI Haitao

Reproductive Center， Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou   325200， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of different concentrations of pentoxifylline on sperm motor function. Methods The semen specimens of 37 patients with weak sperm were used as research objects. All subjects were abstinent for 3-7 days， and all the fresh semen samples were obtained by masturbation. Computer-assisted sperm analysis（CASA） was used to analyze sperm parameters. Pentoxifylline was added to make the final concentration was 0.1 mmol/L， 0.3 mmol/L， 0.6 mmol/L， 1.0 mmol/L， 3.0 mmol/L， 5.0 mmol/L. The sperm motility and sperm motility rate and sperm motor testing （including sperm linear velocity（VSL） and curvilinear velocity（VCL） was detected. Results Compared with the those of 0.1 mmol/L group， the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL in remaining groups increased at different time points（P<0.05）. Compared with those of 0.3 mmol/L group， the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL in 0.6 mmol/L group， 1.0 mmol/L group， 3.0 mmol/L group and 5.0 mmol/L group increased（P<0.05）. Compared with those of 0.6 mmol/L group，the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL increased in the 1.0 mmol/L group， 3.0 mmol/L group and 5.0 mmol/L group（P<0.05）. The sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL in the 1.0 mmol/L group were higher than those of 3.0 mmol/L group and 5.0 mmol/L group（P<0.05）. Compared with those at 10 min， the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL in the different concentration groups increased at 30 min， 60 min and 120 min（P<0.05） except for the 0.1 mmol/L group. Compared with those at 30 min， the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL increased in the different concentration groups at 60 min（P<0.05） except for the 0.1 mmol/L group. Conclusion The concentration of pentoxifylline at 1.0 mmol/L for 60 min has the best effect on sperm function， sperm motility， sperm motility rate and sperm motor function.

[Key words] Pentoxifylline; Sperm motility; Sperm motility rate; Sperm motor function

随着现代社会工业化发展，辐射、药物及环境毒物等的毒副作用及遗传因素的影响，人类的精子数量和质量呈现出普遍下降趋势，男性不孕育的比例显著增加[1-2]。探讨改善和提高男性精子活力和质量的新方法已成为当前生殖医学研究的热点和重点。为改善患者精子活力并增强弱精子症的受精能力，人们已經尝试研究过多种体外精子制备技术和化学刺激试剂，将精子同活力刺激药物混合孵育来改善人工受精和试管成功率[3-4]。己酮可可碱是甲基黄嘌呤中一种，具有改善少弱精子症的活力[5]。因此，本文研究旨在探讨不同浓度己酮可可碱对精子功能的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2017年6～12月在我院就诊的弱精患者37例的精液标本作为研究对象，所有研究对象均依据世界卫生组织（WHO）精子的诊断标准，经医院伦理委员会批准。纳入的37例患者中，年龄21～32岁，平均（27.43±4.13）岁;职业：公务员8例，工人13例，农民12例，其他4例;合并糖尿病5例，合并高血压9例。所有研究对象均禁欲3～7 d后试验。

纳入标准：（1）年龄≥18岁且≤40岁;（2）血常规、肝肾功能正常;（3）获得知情同意，签订知情同意书。排除标准：（1）合并心肺、肝肾功能严重异常者;（2）精神疾病者;（3）合并肿瘤、免疫性疾病及造血系统等异常者。

1.2 方法

所有研究对象均禁欲3～7 d后，采用手淫法取得全份新鲜精液标本，将其放置于37℃条件下，恒温水浴箱中30 min左右，完全液化后备检。用计算机辅助精子分析（CASA）检测精子各项参数，每份标本观察精子数≥200个，且观测15个视野，测定精子活力和活率。

正常精液标本置于37℃水浴箱20 min，待其完全液化后，每份精液各取1 mL，置于离心管内，用含10%血清Earles培养液（美国Sigma公司）1：1对倍稀释;加入10%血清Earles培养液2 mL充分混合均匀，以离心半径10 cm、1500 r/min，离心8 min;将上清液弃去，加入含10%血清Earles培养液2 mL充分混合均匀，以离心半径10 cm、1500 r/min，离心8 min;将上清液弃去，混匀沉淀物，缓慢加入10%血清Earles培养液1.5 mL左右，注意形成界面，放置于37℃5% CO2培养箱中上游30 min;收集云雾状的上清液混合于无菌玻璃管，加入BWW培养液调整精子密度至20×106/mL备用。加入己酮可可碱使其终浓度分别为0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.6 mmol/L、1.0 mmol/L、3.0 mmol/L、5.0 mmol/L。并且在孵育10 min、30 min、60 min、120 min进行活力和活率检测及精子运动功能检测[包括精子直线速度（VSL）和曲线速度（VCL）]。

1.3 观察指标

（1）观察不同浓度己酮可可碱作用不同时间精子活力变化;（2）观察不同浓度己酮可可碱作用不同时间精子活率变化;（3）观察不同浓度己酮可可碱不同作用时间对精子运动功能的影响。

1.4 统计学方法

采用统计学软件SPSS22.0分析处理数据，其中对于多组间计量资料采用方差分析，两组间计量资料采用t检验，组内计量资料采用配对t检验，组间计量资料采用独立样本t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度己酮可可碱作用不同时间精子活力变化比较

见表1。与0.1 mmol/L组比较，其余各组不同时间精子活力均增加（P<0.05）;与0.3 mmol/L组比较，0.6 mmol/L组、1.0 mmol/L组、3.0 mmol/L组和5.0 mmol/L组精子活力增加（P<0.05）;与0.6 mmol/L组比较，1.0 mmol/L组、3.0 mmol/L组和5.0 mmol/L组精子活力增加（P<0.05）;1.0 mmol/L组精子活力高于3.0 mmol/L组和5.0 mmol/L组（P<0.05）;与10 min比较，除0.1 mmol/L组外，其余各组浓度在30 min、60 min和120 min精子活力增加（P<0.05）;与30 min比较，除0.1 mmol/L组外，其余各组浓度在60 min精子活力增加（P<0.05）。

2.2 不同浓度己酮可可碱作用不同时间精子活率变化比较

见表2。与0.1 mmol/L组比较，其余各组不同时间精子活率均增加（P<0.05）;与0.3 mmol/L组比较，0.6 mmol/L组、1.0 mmol/L组、3.0 mmol/L组和5.0 mmol/L组精子活率增加（P<0.05）;与0.6 mmol/L组比较，1.0 mmol/L组、3.0 mmol/L组和5.0 mmol/L组精子活率增加（P<0.05）;1.0 mmol/L组精子活力高于3.0 mmol/L组和5.0 mmol/L组（P<0.05）;与10 min比较，除0.1 mmol/L组外，其余各组浓度在30 min、60 min和120 min精子活率增加（P<0.05）;与30 min比较，除0.1 mmol/L组外，其余各组浓度在60 min精子活率增加（P<0.05）。

2.3 不同浓度己酮可可碱不同作用时间对精子运动功能变化比较

见表3。与0.1 mmol/L组比较，其余各组不同时间VSL和VCL均增加（P<0.05）;与0.3 mmol/L组比较，0.6 mmol/L组、1.0 mmol/L组、3.0 mmol/L组和5.0 mmol/L组VSL和VCL增加（P<0.05）;与0.6 mmol/L组比较，1.0 mmol/L组、3.0 mmol/L组和5.0 mmol/L组VSL和VCL增加（P<0.05）;1.0 mmol/L组VSL和VCL高于3.0 mmol/L组和5.0 mmol/L组（P<0.05）;与10 min比较，除0.1 mmol/L组外，其余各组浓度在30 min、60 min和120 min VSL和VCL增加（P<0.05）;与30 min比较，除0.1 mmol/L组外，其余各组浓度在60 min VSL和VCL增加（P<0.05）。

3 讨论

精子运动是一个高度消耗能量的过程。精子线粒体内产生的ATP可能是精子活动的能量，且受酵解过程直接影响[6]。推测精子代谢过程主要是糖酵解及少量的氧化磷酸化作用所产生，这些过程均受细胞内腺苷酸环化酶系统控制[7-10]。己酮可可碱是从可可豆中提取的可可豆碱，再引入己酮基而得到的一种生物碱，为黄嘌呤衍生物，其分子式为C13H20N4O3，化学名称为3，7-二甲基磺嘌呤，具有类似可可碱、咖啡因和茶碱的特性，是一种非特异性磷酸二酯酶抑制剂，能够阻止环腺苷酸（cAMP）转为腺苷酸（AMP），防止cAMP的降解，从而使细胞内cAMP浓度升高[11-14]。cAMP则是影响精子代谢过程的一个关键因素。大量研究证实，其参与了许多与精子生理和受精能力相关的关键过程：如超激活运动（hyperactivated motility，HAMA）和精子顶体反应（acrosome reaction，AR）[15-16]。

己酮可可碱刺激精子活力及功能的机制尚未被完全阐明。cAMP涉及多种精子功能的调控，如精子尾部轴丝的运动、离子流入和蛋白质的磷酸化作用，影响精子活动所需能量的产生，从而加强人精子的活动能力[17]。cAMP改善精子能力的另一可能机制是调节精子细胞膜上钙离子的转运，引起细胞钙离子发生相应变化，导致细胞内钙水平的变化。钙离子是细胞第二信使，细胞内游离钙离子浓度的改变是细胞生理功能的重要物质基础，也是多种受体激活后信号传递的中心环节。精子膜上含有丰富的多聚不饱和脂肪酸及多种蛋白成分，精子膜完整且具有良好的功能与精子获能、顶体反应及精卵结合密切相关。过氧化物歧化酶可能被一种膜结合蛋白系统调节，PTX刺激这种蛋白激酶系统且抑制活性氧类物质产生，可能作为一种抗氧化剂及自由基清除剂，通过降低细胞内自由基水平，去除自由基上形成的过氧化物而达到保护顶体膜且维护顶体反应的作用[18]。

在哺乳动物精子中如果是短时间用己酮可可碱处理，精子可以对PTX的毒性产生较强的耐受性，而较长时间的处理会对受精卵和早期胚胎产生很强的毒性作用。采用体外活体染色方法观察结果表明：随着己酮可可碱处理精子时间的过分延长，精子膜的完整性明显降低，精子死亡率增加。过多的处理过程本身也可能造成精子功能减退及与透明带结合能力的丧失[19-20]。因此己酮可可碱孵育时间及浓度差异甚至精子的制备，不同的检测方法及评价体系都可能造成最终结果的差异。本文研究表明，1.0 mmol/L组精子活力、精子活率、VSL和VCL高于0.1 mmol/L组、0.6 mmol/L组、3.0 mmol/L组和5.0 mmol/L组，60 min精子活力、精子活率、VSL和VCL高于10 min、30 min和120 min。

综上所述，己酮可可碱浓度1.0 mmol/L孵育60 min对精子功能效果最好，精子活力、精子活率及精子运动功能最佳。由于目前临床上相关研究报道甚少，缺乏有效的临床参考价值。本文作为初步探讨，笔者认为存在一些不足之处，观察研究对象相对较少，纳入浓度相对较少，因此还需在后续进一步研究中增加研究对象和浓度，提供可靠的参考价值。

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