烟草根系分泌物对黑胫病菌菌丝生长的影响

娄晓平，赵炯平，王海波，汪海生，王 钢，朱晓明，时 焦*

1.浙江中烟工业有限责任公司，杭州市中山南路77号 310009

2.中国农业科学院烟草研究所，山东省青岛市崂山区科苑经四路11号 266101

3.江苏省植物保护植物检疫站，南京市鼓楼区月光广场8号 210036

4.华环国际烟草有限公司，安徽省凤阳县门台工业园区 233121

烟草黑胫病［Phytophthoraparasiticavar.nicotianae（Breda de Hean）Tuker］是烟草生产上的一种毁灭性土传病害［1-3］，其发病率轻病区通常为5%～15%，重病区可高达30%以上，个别田块甚至烟株全部死亡［4］。作物品种抗病机理研究是作物病害防治的基础。当植物受到土传病原菌侵染时其根系分泌物对病原菌会产生一定的作用，根系分泌物可以直接影响土传病原菌的生长与繁殖，最终影响植物的发病率。有研究表明，不同抗性的作物品种其根系分泌物对病原菌的影响不同，抗病品种的根系分泌物通常能够抑制病原菌生长，而大多感病品种的根系分泌物则促进病原菌生长［5-9］。汤东生等［10］研究发现，高浓度大蒜根系分泌物能显著抑制石榴枯萎病菌（Ceratocystis fimbriata）菌丝的生长。而有关不同抗性水平烟草品种根系分泌物对烟草黑胫病菌的作用尚未见详细报道。为此，以4个高抗黑胫病的烟草品种和4个高感黑胫病的烟草品种为试验材料，进行了烟草品种根系分泌物对黑胫病菌生长的影响试验，旨在探讨烟草品种对黑胫病的抗性机理，为烟草黑胫病的有效防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病菌：烟草黑胫病菌［P.parasiticavar.nicotianae（Breda de Hean）］0号生理小种，由中国农业科学院烟草研究所植保研究室保存。

供试烟草（Nicotiana tabacum）品种：黑胫病抗病品种 Florida 301、L8、Beinhart1000-1和革新 3号，与黑胫病感病品种中烟100、贵烟13、红花大金元和小黄金1025。在温室中按常规育苗方法培育烟苗，育苗工具、土壤、水和肥料均严格消毒。烟苗培育至6～7片真叶期时备用。

培养基：燕麦固体培养基和马铃薯葡萄糖固体培养基［11-12］。

1.2 方法

采用浸根法分别收集烟草黑胫病抗病品种Florida 301、L8、Beinhart1000-1和革新3号，以及感病品种中烟100、贵烟13、红花大金元和小黄金1025健康烟株的根系分泌物。具体方法：将移栽后2周的烟苗从土壤中取出，用无菌水反复冲洗根系，随后浸入盛有250 mL无菌水的烧杯中，遮光，用烧杯中的水收集各处理根系分泌物12 h。将收集好的浸提液与乙酸乙酯等体积混匀，超声波振荡25 min，静置1 h，然后用分液漏斗分离，将萃取液于旋转蒸发仪40℃水浴中浓缩至浸膏，再用1 mL甲醇溶解，所得液体经0.22µm的微孔滤膜过滤灭菌，获得根系分泌物浓缩液，于4℃冰箱中保存备用［13-14］。

采用生长速率法［13,15］测定根系分泌物对烟草黑胫病菌菌丝生长的影响。将上述制备好的根系分泌物浓缩液与已灭菌并冷却至45℃的马铃薯葡萄糖固体培养基（每100 mL培养基含1%氯霉素抑菌剂0.3 mL）以1∶10比例混合，对照为与浓缩液等量的无菌水与前述马铃薯葡萄糖固体培养基混合，然后倒入直径8.5 cm的培养皿中，静置冷却，冷凝后于每个培养皿中心接种一块直径0.5 cm的黑胫病菌菌饼（提前在燕麦培养基上培养烟草黑胫病菌，然后用直径0.5 cm的打孔器在菌落边缘取菌饼），于28℃恒温培养箱黑暗培养，每24 h用十字交叉法测量菌落直径，共4次。每个品种测试9株，每株重复6次，并计算菌落直径平均值和菌丝生长抑制率。

抑制率=［（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径］×100%

1.3 数据处理

利用DPS数据分析软件，采用Duncan新复极差法对数据进行差异显著性检验［16］。

2 结果与分析

2.1 不同抗性品种烟草根系分泌物对黑胫病菌菌丝生长的影响

表1结果显示，不同抗性烟草品种根系分泌物对黑胫病菌菌丝生长的影响不同。培养24、48、72和96 h抗烟草黑胫病品种Florida 301、L8、Beinhart1000-1和革新3号根系分泌物处理的黑胫病菌菌落直径均显著小于对照（P＜0.05）。说明抗病品种的根系分泌物对黑胫病菌菌丝生长有抑制作用，4个抗病品种的菌丝生长抑制率为5.93%～20.78%。

培养24、48和72 h感病品种贵烟13、红花大金元和小黄金1025根系分泌物处理的黑胫病菌菌落直径均大于对照，差异达到极显著水平（P＜0.01），培养96 h感病品种红花大金元和小黄金1025品种与对照间差异达到极显著水平（P＜0.01）。贵烟13、红花大金元和小黄金1025 3个品种的菌丝生长抑制率为-16.47%～-2.15%。而感病品种中烟100根系分泌物处理培养24、48、72和96 h菌落直径均小于对照，但差异未达到显著水平（P＞0.05），菌丝生长抑制率为0.80%～8.65%（表1）。感病品种中烟100菌落直径与其他感病品种间差异达到极显著水平（P＜0.01）。说明感病品种中烟100的根系分泌物与其他感病品种的作用相反，对黑胫病菌菌丝生长有抑制作用。

表1 不同抗性品种烟草根系分泌物对黑胫病菌菌丝生长的影响①Tab.1 Effects of root exudates from different tobacco varieties on mycelium growth of P.parasitica var.nicotianae

图1 烟草黑胫病菌在8个烟草品种根系分泌物中培养120 h的生长状况Fig.1 Mycelium growth of P.parasitica var.nicotianae on medium with root exudates from 8 tobacco varieties for 120 h

不同烟草品种根系分泌物对黑胫病菌菌丝生长影响的测定结果（图1）显示，抗病品种Florida 301、L8、Beinhart1000-1和革新3号根系分泌物处理的菌落直径明显小于对照。感病品种贵烟13、红花大金元和小黄金1025根系分泌物处理的菌落直径明显大于对照；而感病品种中烟100品种根系分泌物处理的菌落直径略小于对照。

3 讨论

植物根系向根际土壤中释放分泌物，根系分泌物对根际生物包括微生物与植物均具有正面和负面作用［17］。根系分泌物对病原菌的作用方式主要有两种：一是直接作用，根系分泌物或其有效成分对病原菌直接的促进或抑制作用；二是间接作用，根系分泌物通过改变根际微生物结构等方式间接对病原菌产生影响［18］。本试验中发现，烟草根系分泌物对烟草黑胫病菌菌丝生长的作用与品种抗性有关，抗黑胫病烟草品种根系分泌物对黑胫病菌菌丝生长具有明显抑制作用，而感黑胫病烟草品种根系分泌物多数具有明显促进作用，这与前人的研究结果一致。如袁虹霞等［6］研究提出抗病棉花品种根系分泌物对黄萎病病菌的孢子萌发和菌丝生长有一定的抑制作用，而感病棉花品种根系分泌物则能刺激病菌的孢子萌发和菌丝生长；张庆平等［19］和史刚荣等［20］报道荞麦根系分泌物能够抑制小麦全蚀病菌的生长；黄奔立等［21］研究发现感病黄瓜品种根系分泌物对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium）的生长具有促进作用；朱文杰等［22］研究认为，加拿大一枝黄花（Solidago canadensisL.）根系分泌物可有效抑制土传病原菌的生长，随着根系分泌物浓度的升高，土传病原菌生长抑制率提高。而有关抗病烟草品种根系分泌物抑菌物质的有效成分在本试验中尚未涉及，冯超等［23］研究表明，烟草黑胫病感病品种小黄金1025和抗病品种革新3号根系分泌物中，共有成分含量差异较大的化合物为酒石酸、二硝托胺、茉莉酮、棕榈酸和油酸。低浓度（100 μg/mL）条件下5种化合物对烟草黑胫病菌均具有显著的抑制效果,且随浓度的增加其抑制效果增强。因此，在抗病烟草品种根系分泌物抑菌物质的种类鉴定及作用机制方面还有待进一步深入研究。

本试验中还发现感病烟草品种中烟100对黑胫病菌菌丝生长没有促进作用。中烟100品种的感病原因可能是根系分泌物通过改变根际微生物结构等方式而间接对病原菌产生影响。Vives-Peris等［17］报道耐盐与耐高温柑橘品种的根系分泌物能够促进根际细菌的生长，是因为这些根系分泌物中含有大量的脯氨酸与水杨酸盐调控了根际微生物菌群结构。中烟100品种根系分泌物对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制作用可能与烟草品种感病机制的差异有关，这也有待进一步的试验验证。

4 结论

以烟草抗黑胫病品种Florida 301、L8、Beinhart1000-1和革新3号，以及感黑胫病品种中烟100、贵烟13、红花大金元和小黄金1025的盆栽烟苗为试验材料，通过生长速率法测定根系分泌物对黑胫病菌菌丝生长的影响试验结果表明，烟草品种根系分泌物对黑胫病菌菌丝生长的作用与品种抗性有关。4个抗病品种Florida 301、L8、Beinhart1000-1和革新3号的根系分泌物对黑胫病菌菌丝生长有明显抑制作用。感病品种的情况表现不一致，其中感病品种贵烟13、红花大金元和小黄金1025根系分泌物对黑胫病菌菌丝生长有促进作用，而感病品种中烟100没有表现出促进作用，这说明不同抗性水平烟草品种的根系分泌物对烟草黑胫病菌菌丝生长的作用不同。