奶牛场口蹄疫免疫预防技术

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触传染性且能快速远距离传播的动物疫病。口蹄疫能感染猪、牛、羊等主要经济动物和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。发病动物的主要症状是精神沉郁、流涎、跛行、卧地，在其口鼻部、蹄部和母畜乳部等无毛部位发生水疱，水疱破裂后形成溃疡和瘢痂。口蹄疫的发病率高，但大部分成年家畜可耐过。幼畜则经常不见症状而死，死亡率因病毒的毒力不同而有差异，严重时可达100%。口蹄疫可造成巨大经济损失和社会影响。该病是世界动物卫生组织（OIE）法定报告的动物传染病之一。我国于2005年5月24日，中国农业部发布的《动物病原微生物分类名录》（农业部第53号公告）中，将口蹄疫病毒列为一类动物病原微生物。口蹄疫也是《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》中进境动物必须检疫的一类传染病。

一、口蹄疫病毒（FMDV）

口蹄疫病毒属微RNA病毒科的口疮病毒属（包括4种病毒，即牛鼻病毒A、牛鼻病毒B、马鼻病毒A和口蹄疫病毒），口蹄疫病毒为典型代表毒株，也是人类确认的第一个动物病毒病原，开创了病毒学新纪元，是研究最深入的动物病毒之一。

1.口蹄疫病毒结构。电子显微镜观察，口蹄疫病毒颗粒呈圆形，表面光滑，直径为27～30nm（图1）。病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称，由蛋白衣壳包裹基因组RNA组成核衣壳。采用X线晶体衍射技术对多个血清型病毒衣壳的精细结构进行了解分析，衣壳由60个VP1、VP2、VP3和VP4分子组成，其中VP1～VP3位于病毒粒子表面，VP4位于内部，并有一个十四烷基共价键连接到其氨基端。表面结构蛋白VP1、VP2和VP3立体结构相似，是由8个链状β折叠桶（βB、βC、βD、βE、βF、βG、βH、βI）组成（图1-a），β折叠桶之间由表面环结构所连接，表面环含有病毒重要的表位。例如，VP1的βG和βH之间的GH环含有口蹄疫病毒最重要的抗原位点和识别整合素受体的RGD基序。VP1、VP2、VP3和VP4各一个分子组成一个原粒（图1-b,e），相对沉降系数为5S，分子量约为8000ku，5个原粒组成一个五聚体（图1-c,f），相对沉降系数为14S，浮密度为1.5g/mL，分子量为3.8×106ku，12个五聚体构成完整病毒衣壳。自然培养或采用基因工程方法可以获得口蹄疫病毒样颗粒，不含核酸RNA，由VP1、VP3和 VP0（VP2和 VP4前体）组成，沉降系数为75S，分子量为47×106ku。病毒基因组由大约8400个核甘酸组成，为正链单股RNA分子。病毒衣壳和基因组共同组成完整病毒粒子（图1-d,g），其表面不像其他微RNA病毒科成员有许多参与病毒——受体结合的沟或谷，而是相对比较光滑的球面，表面有一细小的环状或纤突突起，五重轴中心点有一个小孔，可以允许小分子进入病毒颗粒，如二乙烯亚胺（BEI）、氯化铯等可以进入病毒颗粒。完整病毒粒子蔗糖密度梯度中的相对沉系数为146S，分子量为8.08×106ku，完整病毒颗粒146S（灭活疫苗的抗原）或75S空壳在酸性、碱性或一定温度条件下降解为12S和5S粒子，降解后小分子（12S、5S）无免疫原性。

2.口蹄疫病毒的分类。血清型：1922-1953年，德、英、法三国学者发现并命名了口蹄疫病毒的7个血清型即 O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型。至20世纪80年代后期已经确定了70～80多个亚型，其中O型有10～11个血清亚型，A型大约有32个血清亚型，C型有5个血清亚型，Asia1型有3个血清亚型。随着新毒株的不断出现，亚型分类越来越混乱，现已放弃亚型分类，采用拓扑型分类。拓扑型：在Rico-Hesse脊髓灰质炎病毒基因分型的基础上，根据变异度最大的VP1核酸序列，将同一血清型中关系密切的一组病毒分为不同拓扑型，拓扑型毒株具有明显的地域性。目前O型口疫病毒有10个拓扑型，A型有3个拓扑型、C型有8拓扑型、亚洲1型有1个拓扑型，SAT1、SAT2和SAT3分别有3、2和3个拓扑型。我国曾经流行过的有O、A和亚洲1三个型，2018年7月1日亚洲1型退出免疫之后，主要流行毒株为O型和A型，其中O型的流行毒株有三个拓扑型——东南亚拓扑型（如O/Mya98/BY/2010等）、中东-南亚拓扑型又叫泛亚拓扑型（如O/Ind2001等）和古典中国拓扑型（如O/GX/09-7等）。A型的流行毒株只有一个拓扑型及东南亚拓扑型（如A/Sea-97/G2 等）。

3.口蹄疫病毒的易感动物及感染特点。口蹄疫的易感动物种类繁多。重要家畜如猪牛、羊等都易感，其中牛的发病率几乎达100%，其次是猪，再次是羊及20多科70多种野生动物。

口蹄疫病毒变异性极强，其7个血清型之间不能产生交叉免疫，因此防治口蹄疫相当于防治7种不同的传染病。同型内不同病毒株的抗原性也有差异，而新毒株又不断出现，每出现一种新毒株，疫情就出现一次新高潮。

口蹄疫病毒的感染性和致病力特别强。如一头牛只要吸入10个感染单位的病毒就可发病，而病畜的排毒量又特别大，一头病猪每天仅从呼吸道排出的病毒就高达108个感染单位。一头病猪一天呼出的病毒可使1000万头牛发病。

口蹄疫有多种传播方式和感染途径。该病不但可通过与病畜接触传播，还可通过空气传播。若气象条件合适，病毒可向下风方向传播几十甚至上百公里的距离。

口蹄疫的潜伏期短，发病急。动物感染口蹄疫病毒后最快十几小时就可排毒，处于潜伏期的动物、发病动物及持续感染动物均可引起易感动物发病。

动物机体对口蹄疫病毒的免疫应答程度较低。免疫注射动物，甚至发病后康复动物，再次受到同源病毒攻击时只保持不再发病，其免疫系统不能完全抵抗病毒感染。

二、奶牛发病时的临床症状

在所有易感动物中奶牛最易感染口蹄疫病毒，感染后临床表现十分明显，以口腔和蹄部出现水疱为主要特征。牛群一旦感染口蹄疫病毒，传染速度很快，出现相同症状的病牛数量急剧增加。牛自然感染口蹄疫病毒时，潜伏期一般为2～14d，但是，随着环境的变化，潜伏期亦可缩短或延长。

患病初期，病牛出现急性发热，体温可以升高至40～41.5℃，稽留1～4d。伴随精神沉郁、脉博加快、黏膜潮红、反刍减弱和产奶量下降等症状。牛感染24h后出现病毒血症，在病毒血症期间，从多数组织中可检测到病毒，其中蹄叉、蹄冠部和舌上皮组织中的病毒含量最高。

病牛蹄部病变主要发生在蹄叉、蹄冠及蹄踵和趾间隙的柔软皮肤，初期表现局部有热感、红和疼痛，之后形成小水疱，继而融合为较大的水疱。水疱破溃时水液排出形成糜烂，其表皮常不完全脱落而干燥形成硬痂，有时蹄冠部发生多处水疱，互相连接融合，引起蹄冠与蹄缘分离，病愈后较长时间内，仍留有明显的缝隙和痕迹，病牛因蹄部疾患常常举步艰难。蹄部水疱破溃后，若护理良好、保持清洁干燥，经10～14d可以自愈，否则病程很长，严重时，蹄匣脱落。

在蹄部发生水疱的稍前或同时，出现口腔病变，一般是在舌背面出现环形、粗糙的白色隆起，随着液体的积聚，隆起增大，有时多个水疱相互融合，凸现于正常的舌面组织使舌面凹凸不平。牛流出大量泡沫样口涎，并挂满口角与下唇。水疱破裂后，舌面露出红色烂斑。病牛多因口腔疼痛不能吃草而日渐消瘦。水疱也会出现在齿龈、舌面、鼻镜、唇内、鼻前端及眼结膜等处，水疱一般较小，为绿豆或指头蛋大小，破裂后形成局限性小烂斑。

泌乳牛感染口蹄疫时，乳头皮肤亦可出现水疱。口蹄疫还会引起怀孕母牛流产、死胎或分娩出带病毒的犊牛。此外，病变也见于鼻咽部、食道和瘤胃，亦见于母牛阴道基膜和公牛阴囊皮肤。成年发病牛的死亡率通常比较低，而发病犊牛死亡率高。新生牛呈急性经过而不形成水疱性病损，经过1～2d，因心肌炎而死亡。

成年病牛一般1～2周后即可痊愈，部分病例由于继发细菌感染，使病变过程复杂化，口腔出现深层溃疡、坏死和脓肿，并可能发展为咽炎、支气管炎，肺水肿和肺气肿；蹄冠部化脓，出现坏死性蜂窝织炎，发生感染的关节与腱鞘松弛，有时伴随败血症而导致病牛死亡。部分病牛康复后，可能发生继发症，表现为精神沉郁，食欲减退，换毛过程停滞，奶产量降低。有些病牛出现心肺性喘息和咳嗽，心博减弱，脉博无力，心悸亢进和心律不齐，瘤胃蠕动减弱，有时出现抽搐兴奋或精神沉郁。

三、口蹄疫免疫技术

目前，我国政府批准用于预防口蹄疫的疫苗包括单价、双价或三价灭活油佐剂疫苗、合成肽疫苗及基因工程亚单位疫苗。其中合成肽疫苗仅用于猪口蹄疫的防控，基因工程亚单位疫苗因其抗原分子量小、免疫原性弱而未能大面积推广使用。灭活疫苗因效果良好而且质量稳定，是当前乃至今后畜牧业生产中预防口蹄疫的主要疫苗。

1.疫苗选择。2018年7月1日，我国宣布亚洲1型口蹄疫退出免疫，目前至今后主要用于牛羊的口蹄疫疫苗有以下几种。

1）牛口蹄疫O型、A型双价灭活疫苗。O型、A型病毒，灭活前的病毒含量分别至少107.0TCID50/mL，用于预防牛、羊O型、A型口蹄疫。注射后15d产生免疫力，免疫期为6个月。牛、羊深部肌内注射，6月龄以上牛4mL/头，6月龄以下牛和1岁以上羊2mL/头，6月龄以下的羊1mL/只。

2）口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗（O/MYA98/BY/2010株+Re～A/WH/09株）。本品系用口蹄疫病毒O型O/MYA98/BY/2010株、重组A型Re～A/WH/09毒株分别接种BHK～21悬浮细胞，收获细胞培养物，分别经浓缩纯化、二乙烯亚胺（BEI）灭活后与ISA206佐剂按比例混合乳化制成疫苗。用于预防牛、羊O型和A型口蹄疫，免疫期为6个月，肌肉注射，牛1mL/头，羊0.5mL/只。

3）口蹄疫（A型）灭活疫苗（AF/72株）。本品系用牛源A型口蹄疫病毒AF/72株细胞毒，接种BHK-21细胞，通过浓缩培养法培养，收获细胞培养物，经二乙烯亚胺（BEI）灭活后，加矿物油佐剂混合乳化制成。用于预防牛A型口蹄疫，免疫期为6个月，肌肉注射，6月龄以上成年牛2.0mL/头，6月龄以下犊牛1.0mL/头。

4）口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗（O/HB/HK/99株+AF/72株）。本品含灭活的口蹄疫O型（O/HB/HK/99株 ）、A型（AF/72株 ） 病毒，灭活前的病毒含量分别至少为107.0TCID50/mL。用于预防牛口蹄疫O型、A型病毒引起的口蹄疫，免疫期为6个月，肌肉注射 2mL/头。

5）口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗（OHM/02株+AKT～III株）。疫苗中含有灭活的口蹄疫O型毒株（OHM/02株）和A型Ⅲ系鼠化弱毒株（AKT-III株），灭活前的病毒含量均至少为107.5LD50/0.2mL。用于预防牛、羊O型、A型口蹄疫，免疫期为6个月，颈部肌肉注射，牛2.0mL/头，羊1.0mL/只。

6）口蹄疫O型灭活疫苗（OJMS株）。本品系用口蹄疫病毒O型病毒接种BHK-21细胞培养，收获悬浮细胞培养物，经二乙烯亚胺（BEI）灭活，加矿物油佐剂混合乳化制成。用于预防牛、羊O型口蹄疫，肌肉注射，牛2.0mL/头，羊1.0mL/只。

7）口蹄疫O型灭活疫苗（OS株）。含灭活的口蹄疫O型病毒，灭活前每0.1mL病毒含量应至少为107.0TCID50，或每0.2mL病毒含量应至少为107.0LD50。用于预防牛、羊、鹿和骆驼O型口蹄疫，免疫期为4～6个月。肌肉注射，牛、鹿和骆驼2mL/头（峰），羊1mL/只。

8）口蹄疫O型灭活疫苗（OHM/02株）。疫苗中含灭活的口蹄疫O型病毒OHM/02株，灭活前的病毒含量应至少为107.0LD50/0.2mL。用于预防牛、羊O型口蹄疫，免疫期为6个月。肌肉注射，牛2.0mL/头，羊1.0mL/只。

2.免疫操作。免疫前要严格做好接种器具（注射器，针头、镊子以及有关容器等）的消毒准备工作。

1）最好使用一次性注射器，或者使用牲畜专用的可定量注射器，注意注射器定量卡是否松动，用前高压灭菌或煮沸消毒法消毒至少15min。

2）使用12～16号针头。针头的消毒应采用高压蒸汽法。

3）毛剪和镊子使用前应高压灭菌或煮沸消毒法消毒至少15min。

4）灭菌后的注射器与针头应放置于无菌盒内备用。免疫接种工作由兽医防疫人员或养殖场兽医人员执行。做好养殖场兽医人员的技术培训，严格按接种操作要求进行。接种前应备有足够的碘酊棉球、注射器、针头、抗过敏药物以及免疫记录本等。免疫注射时应适当保定动物，严禁使用“飞针”注射。接种前将疫苗缓慢充分摇匀，防止气泡影响疫苗剂量的准确性。疫苗在使用过程中应保存在保温箱内，注意防冻、防晒，疫苗必须在2～8℃之间保存，切不可冻结。吸出的疫苗不可回注于疫苗瓶内，每瓶疫苗启用后，限当日用完，超过24h则废弃。

严格按照产品说明书中限定的剂量免疫。注射部位要准确，动作要熟练，确保免疫剂量准确足量。吸取疫苗时应在疫苗瓶边缘插入一支进气针头，吸苗针头应从瓶塞中央进人并固定在瓶塞上专用于吸取疫苗，另安装注射针头用于疫苗接种。接种前应仔细定量，在注时针头上覆盖棉球，将针筒排气溢出的疫苗液吸积于棉球上，并将其收集于专用瓶内集中处理。进气针头、吸取针头和注射针头三者之间应严格分开使用，注射器严禁在疫苗瓶内排空气。注射部位用碘酊或70%酒精棉擦净消毒。牛注射部位为颈部上1/3处深层肌肉。

3.免疫不良反应的预防及处理。

通常大多数牛在接种疫苗后不会出现明显的不良反应，而少数牛常会出现一过性的精神沉郁、食欲下降，注射部位出现短时轻度炎性水肿等局部或全身性异常表现，这都是注苗后的正常反应。但有时会发生反应程度严重（如过敏反应，表现为缺氧、黏膜发绀，呼吸困难、口流白沫，全身肌肉颤抖、出汗，呕吐食物、虚脱或惊厥等临床症状）或出现反应的牛数量较多的情况，原因通常是由于疫苗的质量低劣、注射剂量过大、操作错误、接种途径或使用对象不准等因素引起。即便如此，我们仍可以通过一些预防和应急措施最大程度地减少注射疫苗的不良反应和损失。

1）不良反应的预防。接种前后一周内饲料中可适当添加小剂量的左旋咪唑、亚硒酸钠和维生素E等免疫增强剂类物质。不要使用肾上腺素类的激素药物或免疫抑制性药物（如链霉素、新霉素、卡那霉素、四环素等）或抗病毒药物。

在免疫接种前必须进行牲畜健康状况、体质等生理状况的检查，病畜、弱畜、孕畜可暂缓接种，其免疫严格按说明书要求进行及时补免。

免疫接种最好选择在温度适宜、天气晴朗的时候进行，特别是猪的免疫应尽量避开阴雨天，夏季在早晚凉爽时进行，冬天在中午温暖时进行。

免疫接种前应尽可能避免动物一些剧烈活动（如长途运输、转群、采血等），防止牲畜处于应激状态，在接种过程中更应采取必要措施以避免过分驱赶或抓取牲畜。

免疫后须给牲畜适当时间休息，同时兑制多维电解质水供其自由饮用，并密切观察是否出现异常反应，对表现持续高热的牲畜除了供给充足的多维电解质水之外，还需采取退热措施。

2）不良反应的处理

一般反应：个别牛注射疫苗后出现轻度精神萎靡或不安，食欲减少和体温稍高等情况，一般不需要治疗，将其置于适宜环境下1～2d，症状即可自行减轻或消失，不必采取治疗措施。

急性不良反应：极个别牛注射苗后可能出现急性过敏反应，呼吸加快、眼结膜充血、发抖、皮肤发紫、口吐白沫、频频排便、后肢不稳或倒地抽搐，如抢救不及时很可能死亡。一般需尽快肌注地塞米松磷酸钠30mg，皮下注射0.1%盐酸肾上原素5mL。若发生过敏反应病牛体温超过40℃，可注射复方氨基比林。若发生过敏反应的病牛心脏衰竭、皮肤发紫，可注射安钠咖，注意保温，并给予充足、干净的饮水。

最急性不良反应：迅速皮下注射0.1%盐酸肾上腺素5mL，20min后根据缓解程度，可重复同剂量再注射一次。对休克牛，除上述方法外，还要迅速针刺耳尖、尾根、蹄头、大脉穴，放少量血，迅速将去甲肾上腺素10mg加入10%葡萄糖注射液1500mL，静脉滴注，待其苏醒、脉律恢复后，再将VC 5g、VB6 3g加入5%葡萄糖注射液2000mL静脉滴注，然后再用5%的碳酸氢钠注射液500mL静脉滴注即可。

4.免疫程序。根据疫苗种类和群体免疫抗体水平制定适宜的免疫程序，并严格按免疫程序实行免疫接种工作，但根据突发事件和实际情况的变化可以调整免疫程序。生产母牛，每年普免2～3次。犊牛，出生后3～4个月首免，间隔3～4周二免。种公牛，每年普免3次。补充免疫：按程序免疫之后经免疫抗体检测针对免疫抗体产生不佳的牛可进行补免。紧急免疫：当地发生疫情时，要对疫区、受威胁区域的全部易感动物进行一次强化免疫。

5.免疫标识与免疫档案

1）养殖场应每季度提前向动物防疫主管部门申报养殖种类、养殖数以及所需的动物标识数量，年存栏1000头以上场须自行配备动物标识识读器。

2）对动物免疫接种后须按照《畜禽标识和养殖档案管理办法》中的规定，建立免疫档案，加施牲畜标识。

3）免疫接种后应及时认真地填写免疫接种记录表，内容包括疫苗名称、接种日期、舍号、栏号、年龄、免疫头数、免疫剂量、疫苗信息（类别、生产厂家、有效期、批号等）以及接种人员，针对每一头牲畜建立规范性的免疫档案。

6.口蹄疫监测。监测措施是口蹄疫防控和流行病学调查的重要内容和手段之一，所有影响口蹄疫发生与扩散的风险因素都属于监测范围。而规模养殖场口蹄疫发生风险的监测内容主要是场区环境带毒检测，场区外环境的疫情调查、牲畜过往活动情况、牲畜带毒情况以及畜群免疫状况等。

1）监测范围。①牛群：养殖场内牛群发病、带毒及抗体水平的检测。②场区内环境：含饲料、饮用水等带毒监测。③场区外环境：关注养殖场周边范围内的疫情动态，包括疫情调查，场区附近过往易感动物（牛、羊、猪）活动情况等。

2）监测频率。①集中监测：1年2次，分春秋季。春季集中监测在5月底前完成，秋季集中监测在11月底前完成。②日常监测：各养殖场根据生产的实际情况随时自行监测，必要时，结合当地口蹄疫流行状况增加监测次数。一旦发现疑似病例，应紧急封锁疫点、控制发病动物及同群牲畜，并立即报告当地动物防疫监督部门。

3）监测内容和方法。①临床检查：由饲养员负责每日例行的临床检查，即仔细观察牛只是否表现口蹄疫临床典型症状（如食欲减退、发热、口及乳房部位出现水疱、跛行、喜卧等）。一旦发现异常情况，应立即报告养殖场兽医和负责人员。②实验室检测：由养殖场兽医诊疗室（若技术和装备条件允许）负责实施，进行血清样品的抗体检测。

液相阻断酶联免疫吸附试验（LB-ELISA）用于口蹄疫免疫抗体水平的检测和评价，是OIE推荐的国际标准方法之一。根据口蹄疫的流行和免疫情况，有时需检测多个血清型的免疫抗体。

正向间接血凝试验（IHA）适用于口蹄疫免疫抗体水平的大规模监查。虽非国际标准方法，但因其操作简便，价廉。在基层兽医实验室仍有较大应用价值。

4）样品采集。①采样原则：根据检测目的采集相应样品，采集的检测样品要有代表性，样品的采集、保存、运输要按国家《口蹄疫防治技术规范》技术标准进行。②采样数量：样品采集总量应根据养殖场实际的养殖规模、牲畜用途、畜群大小确定。基本原则是必须符合统计学要求。③采样时间：为监测养殖场动物血清抗体水平，评估疫苗免疫效果，应分别在注苗前和注苗后30d采集血清样品1次进行检测。

5）检测结果的判定。液相阻断ELEA，免疫后30d抗体效价≥26为免疫合格。

6）免疫效果的评价。存栏猪群免疫抗体合格率≥70%，牛群免疫抗体合格率80%时，表明家畜群体的免疫水平达到了国家规定要求。未达抗体合格标准的，应及时进行补免。