羊群布鲁氏菌病免疫检测比较试验

李洁 孙涛 孙玉霜 曹建森 刘建文

1.天津市动物疫病预防控制中心

2.天津市西青区畜牧兽医站

布鲁氏菌病（Brucellosis），又称地中海弛张热、马耳他热、波浪热，是由布鲁氏菌引起的人和牛、羊、猪等的重要人畜共患病。羊是重要易感动物,以母畜流产和公畜睾丸炎为主要特征。世界动物卫生组织（OIE）将布鲁氏菌病列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。布鲁氏菌病的流行严重影响我市畜牧业发展和公共卫生安全。

天津市属于布鲁氏菌病防控一类地区，我市采取肉羊布鲁氏菌病强制免疫和监测净化的防治策略，对种羊采取非免疫监测净化的策略。本试验采用三种不同血清学检测方法——布鲁氏菌病抗体cELISA检测技术、免疫胶体金快速检测技术及虎红平板凝集检测技术，在羊群经口免疫S2疫苗后进行抗体监测，旨在了解羊群免疫布鲁氏菌S2疫苗后的抗体阳性率消减规律及不同血清学检测方法敏感性的比较，为制定科学合理的免疫净化程序和抗体检测方法的选取提供理论依据，为我市肉羊布鲁氏菌病免疫和防控工作提供参考。

一、材料与方法

1.实验材料试验设计

1）试验动物。随机选取某集约化肉羊养殖场60日龄健康绵羊30只。肉羊的饲养场所、饲料、饲养人员等养殖情况均相同。

2）免疫疫苗。羊群免疫所用疫苗为同一批次布鲁氏菌弱毒活疫苗（S2株），疫苗在有效期内，购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司。

3）诊断试剂。三种血清学检测试剂分别是：虎红平板凝集试验抗原及阴阳性对照血清（购自中国兽医药品监察所）、牛布鲁氏菌病抗体胶体金检测卡（购自深圳市绿诗源生物技术有限公司）、牛布鲁氏菌病抗体ELISA试剂盒（由哈尔滨兽医研究所提供）。

4）仪器设备：移液器、离心管、离心机、酶标仪。

2.试验方法。对备选健康羊群经口免疫接种布鲁氏菌病（S2）弱毒苗，标准剂量为6×1010CFU活菌。免疫后分别用布鲁氏菌病虎红平板凝集试验、牛布鲁氏菌病抗体胶体金快速检测技术和牛布鲁氏菌抗体ELISA试验方法。对免疫奶牛持续进行抗体监测。分别在免疫前和免疫后7d、15d、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月采集全血检测。

3.结果判定。布鲁氏菌病虎红平板凝集试验按照国标（GB/T 18646-2002）进行操作和结果判定。虎红平板凝集试验在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性(+)，无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性(-)。

布鲁氏菌病抗体快速检测试纸条表面有字母“T”和“C”作为测试线和控制线。在提供任何样品前，测试线和控制线在结果窗中都不显示。控制线被用作程序控制。如果测试正常的完成，控制线试剂会工作，而且控制线会始终显示。如果在样品中含有足够的布鲁氏杆菌抗体，一条紫色的测试线会在结果窗口中显示。

cELISA的判定标准为：在阴阳性对照结果成立的情况下，抑制率（PI）≥30%判为阳性，抑制率（PI）＜30%判为阴性。

图1 肉羊经口免疫布鲁氏菌病S2疫苗后抗体阳性率消减规律

二、结果

肉羊经口免疫布鲁氏菌病S2疫苗后抗体阳性率消减规律见图1。肉羊经口免疫布鲁氏菌病S2疫苗后三种方法检测阳性率统计见表1。

表1 肉羊经口免疫布鲁氏菌病S2疫苗后三种方法检测阳性率（%）

三、分析与讨论

1.免疫前使用血清学三种方法对30只健康羊进行检测，检测结果均为抗体阴性，符合试验条件。5月4日对30只羊进行免疫。免疫后7d出现抗体阳性结果。根据羊群免疫后抗体消长规律曲线显示，免疫后1周可以检测到免疫抗体，15d开始抗体阳性率进入高峰期。也有研究表明，羊群免疫S2疫苗后，在15～30d抗体凝集达到高峰。本试验显示，免疫抗体高峰持续50d左右，随后群体中动物抗体检测阳性率逐渐下降，5～6个月以后基本无法检测到免疫抗体。免疫后5个月采血，三种方法均未检测出阳性。

2.布鲁氏菌弱毒活疫苗（S2）免疫健康羊群后能够有效激发免疫应答，检测抗体阳性率上升。布病疫苗以黏膜免疫和细胞免疫为主，现有血清学检测方法主要用于体液免疫抗体的检测，因此在免疫高峰期的抗体阳性率仅为50%。免疫后，血清学检测阳性率不能完全体现个体抗体覆盖率。

3.布鲁氏菌免疫后期虽然检测抗体阳性率逐渐下降，但是羊群仍然能够保持一定的黏膜免疫和细胞免疫的保护力。临床上在肉羊免疫净化工作中推荐为每年定期免疫布鲁氏菌病疫苗1次，每次免疫前进行血清学筛查，发现检测阳性肉羊进行扑杀并进行无害化处理。逐年免疫清群，能够减低个体流行率，逐年清群后可达到布鲁氏菌病净化的目的。

4.三种检测方法进行比较，其中虎红平板试验和胶体金两种方法具有操作简单、快捷、便宜等特点，虎红平板凝集试验的结果根据肉眼判定，存在主观偏移，可能造成结果偏差。而cELISA的试剂和设备成本较高，优点是检测敏感性和特异性较高且可以批量检测。虎红平板凝集试验推荐用于临床初步筛查，可以使用cELISA进行确诊。