电针对糖尿病神经痛大鼠脊髓星形胶质细胞活化的影响

瞿思颖 邰昭霞 费雪瑜 邵晓梅,3 何晓芬,3 方剑乔,3 蒋永亮,3

1.浙江中医药大学第三临床医学院 杭州 310053 2.浙江省针灸神经病学研究重点实验室 3.浙江中医药大学针灸研究所

糖尿病具有多种并发症，糖尿病神经痛（diabetic neuropathic pain，DNP）就是其中一种，其发病率很高[1]，严重影响患者生存质量，目前药物治疗方案有限，而且疗效不佳。DNP常表现为痛觉敏化[2]，其中中枢敏化是DNP发生、维持的主要机制之一，主要涉及脊髓背角神经元的超兴奋性。有研究表明，星形胶质细胞在DNP的发病过程中发挥重要作用[3]，已成为治疗DNP的重要靶点，而星形胶质细胞活化的重要标志物之一为胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。也有研究表明，脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDA）受体2B亚基磷酸化（phospho-N-methyl-D-aspartic acid receptor 2B subunit，p-NR2B）与 DNP 的产生与维持相关[4]。

针刺是控制慢性疼痛的主要手段之一，临床随机对照研究证实针刺或电针（electroacupuncture，EA）可有效控制DNP[5-7]。已有研究表明，低频EA干预DNP优于高频[8]，但是其具体机制有待进一步明确。本实验通过建立DNP大鼠模型，观察大鼠L4～L6脊髓背角星形胶质细胞活化情况及p-NR2B表达的变化，为应用EA干预DNP提供重要的科学依据与理论阐释。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠26只购于中国科学院上海实验动物中心[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016]，35 周龄，体质量（135±15）g，饲养于浙江中医药大学实验动物中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2013-0184]。正常组大鼠予以啮齿类动物标准颗粒饲料喂养，高脂高糖饲养组予以高脂高糖饲料喂养，均自由饮水。饲养室温度维持在（24±2）℃，12h灯光昼夜循环。

1.2 主要仪器与试剂 HANS 200E型韩氏穴位神经刺激仪购于北京华卫产业开发公司；37450型动态足底触觉仪为意大利Ugo Basile公司产品；激光共聚焦显微镜购于日本Nikon公司。兔抗大鼠GFAP多克隆抗体购于美国abcam公司（批号：GR154650-5）；兔抗大鼠p-NR2B抗体购于美国GeneTex公司（批号：821502001）；驴抗兔 Alexa Fluor488 IgG（H+L）二抗购于美国Jackson Immunolab公司（批号：138271）。

1.3 造模与分组 以完全随机分组法将大鼠分为正常组（6只）与高脂高糖饲养组（20只）。正常组大鼠予以普通饲料喂养，高脂高糖饲养组大鼠予以高脂高糖饲料喂养5周，继以腹腔注射35mg/kg的链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），正常组给予相同剂量的柠檬酸缓冲液腹腔注射。STZ注射3d后检测空腹血糖，血糖稳定且≥11.1mmol·L-1的大鼠入选实验。2周后检测大鼠的机械痛阈，血糖升高和痛阈下降作为DNP模型造模成功的标准。高脂高糖饲养组大鼠中2只死亡，4只血糖未升高，2只痛阈未下降，最终造模成功的大鼠共12只。将造模成功的大鼠分为DNP模型组和EA组，每组6只。

1.4 EA干预 造模成功后开始EA干预，采用0.25mm×13mm的毫针，选用双侧“足三里”“昆仑”穴，进针后连接韩氏穴位神经刺激仪。电针参数：频率2Hz，强度1mA，干预 15min；2mA 干预 15min，共 30min，1 次/d，持续1周。

1.5 痛阈测定 采用动态足底触觉仪检测大鼠机械缩足反射阈值（paw withdrawal threshold，PWT）[9]。分别于造模前、造模后5、7和8周进行检测，测量前将大鼠置于塑料盒内适应环境20min，待大鼠安静后，用金属丝对大鼠足底给予机械刺激。刺激力量从0g开始，以2.5g/s的速度递增，最大刺激力量为50g，避免大鼠足底受伤。共检测5次，每次检测间隔5min，去掉最大值和最小值，取余下3次的平均值。

1.6 免疫荧光检测大鼠腰段脊髓背角GFAP、p-NR2B阳性细胞表达 大鼠经10%水合氯醛（0.35mL/100g）腹腔麻醉后，以4℃的0.9%氯化钠溶液经左心室、升主动脉快速灌注，再以4%多聚甲醛灌注后快速分离脊髓L4～L6节段。将脊髓置于4%多聚甲醛溶液中固定6h，经15%和30%的蔗糖溶液梯度脱水，液氮快速冷冻后，行30μm冰冻切片。脊髓切片以TBST漂洗5min，漂洗3次后，转入24孔板，加入10%驴血清，37℃孵育1h。分别加入以含10%驴血清的TBST稀释的兔抗大鼠GFAP抗体（稀释比例1：1 000）和含10%驴血清的TBST稀释的兔抗大鼠p-NR2B抗体（稀释比例 1：400）。4℃过夜后，TBST 漂洗切片 10min，共漂洗3次，加入含10%驴血清的TBST稀释的Alexa Fluor488驴抗兔IgG二抗（稀释比例1：400）进行免疫荧光标记，37℃避光孵育1h，TBST清洗3次。将脊髓切片转移至黏附载玻片上，晾干后滴加抗荧光淬灭封片液，以盖玻片封片，激光共聚焦显微镜下观察并拍片。每只大鼠选用3张脊髓切片，采用Image-Pro Plus 6.0病理图像分析系统对腰段脊髓背角浅层阳性细胞表达率进行统计。阳性细胞表达率（%）=脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层阳性像素点/脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层总像素点×100%。

1.7 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠PWT比较 造模前各组大鼠PWT差异无统计学意义（P＞0.05），造模第5周高脂高糖饲养后STZ注射前，各组大鼠PWT差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后第7周，与正常组比较，DNP模型组和EA组大鼠PWT明显下降（P＜0.01）。造模后第8周，与正常组比较，DNP模型组大鼠PWT明显下降（P＜0.01）；与DNP模型组比较，EA组大鼠PWT明显升高（P＜0.01）。见图1。

图1 各组大鼠PWT比较Fig.1 Comparison of PWT in each group

2.2 各组大鼠腰段脊髓背角GFAP表达比较 各组大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层GFAP阳性细胞见图2。与正常组比较，DNP模型组大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层GFAP阳性表达率明显升高（P＜0.01）；与DNP模型组比较，EA组大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层GFAP阳性细胞表达率明显降低（P＜0.01）。见图3。

图2 各组大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层GFAP阳性细胞（100×，标尺：100μm）Fig.2 GFAP positive cells in lumbar spinal cord dorsal horn laminae Ⅰ～Ⅱ in each group(100×,scale bar：100μm)

图3 各组大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层GFAP阳性细胞表达率比较Fig.3 Comparison of positive ratio of GFAP in lumbar spinal cord dorsal horn laminaeⅠ～Ⅱ in each group

从细胞形态学角度观察，正常组大鼠脊髓背角星形胶质细胞呈分支状，细胞胞体小，分支长而细，处于静息状态；DNP模型组大鼠脊髓背角星形胶质细胞胞体变大，分支变短，处于激活状态，EA组大鼠星形胶质细胞虽处于激活状态，但胞体较小。见图4。

图4 各组大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层GFAP阳性细胞形态Fig.4 Morphology of GFAP positive cell in lumbar spinal cord dorsal horn laminaeⅠ～Ⅱ in each group

2.3 各组大鼠腰段脊髓背角p-NR2B表达比较 各组大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层p-NR2B阳性细胞见图5。与正常组比较，DNP模型组大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层p-NR2B阳性细胞表达率明显升高（P＜0.01）；与DNP模型组比较，EA组大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层p-NR2B阳性细胞表达率明显降低（P＜0.05）。见图6。

图5 各组大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层p-NR2B阳性细胞（100×，标尺：100μm）Fig.5 P-NR2B positive cells in lumbar spinal cord dorsal horn laminae Ⅰ～Ⅱ in each group(100×;scale bar：100μm)

图6 各组大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层p-NR2B阳性细胞表达率比较Fig.6 Comparison of positive ratio of p-NR2B in lumbar spinal cord dorsal horn laminaeⅠ～Ⅱ in each group

3 讨论

近年来，糖尿病患者数量急剧上升，糖尿病并发症已成为糖尿病患者主要死因之一，严重威胁着人类的健康，由此产生的医疗费用也给个人和社会经济等带来了沉重的负担[10]。临床上大约50%的糖尿病患者合并DNP，而DNP是糖尿病周围神经病变中较为严重的一种[1]。

研究证实，DNP主要表现为痛觉敏化[11]，而中枢敏化是DNP发生、维持的关键机制，涉及脊髓背角神经元的超兴奋性。星形胶质细胞是兴奋性神经递质代谢的重要场所之一，很多细胞因子和生长因子从激活的星形胶质细胞释放，导致细胞周围的化学环境改变，引发中枢敏化。然而，以神经细胞为作用靶点的药物疗法效果常常不够理想。GFAP是星形胶质细胞活化的标志物之一。多种疼痛动物模型中均可观察到脊髓星形胶质细胞的活化增殖反应和其特征性标志物GFAP的表达增加[12-13]。还有研究证实，疼痛模型中伴有星形胶质细胞的形态改变，表现为细胞聚集、胞体变大、分支变多、GFAP灰度值增强等[14]。Liddelow等[15]发现，疾病状态下静息的星形胶质细胞会转变为具有神经毒性的A1表型，后者可以产生大量的炎症因子。注射星形胶质细胞抑制剂氟代柠檬酸能明显减轻由神经损伤和炎症因素引起的痛觉过敏和异常性疼痛[16-17]。以上研究提示星形胶质细胞在神经病理性疼痛发生和发展过程中发挥着重要作用。

NMDA受体是以谷氨酸为神经递质的离子型受体，其中NR2B是NMDA受体的调节亚基，在脊髓背角呈选择性高表达。有研究表明，鞘内注射NMDA受体NR2B亚基特异性拮抗剂艾芬地尔治疗神经痛时，脊髓背角NR2B亚基的表达明显降低，提示脊髓背角NR2B亚基参与神经痛的形成[18]。NR2B亚基磷酸化会影响NMDA受体的数量及功能，从而参与中枢敏化[19]。也有研究表明，脊髓背角NR2B亚基的表达量与DNP的产生与维持相关[4,20]。Wang等[21]研究表明，NMDA受体的亚基NR2B的表达与星形胶质细胞的活化有着密切的关系。有报道证实，EA可通过抑制脊髓背角NR2B亚基表达，从而提高神经病理性疼痛或炎性疼痛模型的痛阈[22-23]。也有研究表明，EA通过抑制脊髓背角GFAP活化对神经病理性疼痛产生镇痛作用[24]。

本实验通过高脂高糖饲养联合腹腔注射STZ诱导DNP大鼠模型，初步探讨了EA对DNP模型大鼠脊髓背角星形胶质细胞活化和p-NR2B表达的影响。结果表明，EA可提高DNP大鼠PWT，免疫荧光显示DNP模型组大鼠脊髓背角星形胶质细胞表达明显增多，并且处于高度活化状态；EA可明显抑制DNP模型大鼠脊髓背角星形胶质细胞活化，并且能抑制脊髓背角p-NR2B的表达。综上所述，EA对DNP大鼠具有镇痛作用，其可能的机制是抑制脊髓背角星形胶质细胞活化和p-NR2B的表达。在未来的研究中将采用免疫荧光双标法检测GFAP和p-NR2B的共表达，并通过GFAP和NR2B的特异性激动剂的鞘内注射，进一步观察其对针刺镇痛效应的影响。