钙周期素结合蛋白促进胃癌细胞迁移侵袭和MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2、p-AKT水平上调

张萌，张向东，夏永欣，刘晓政

（南阳市中心医院消化科 南阳473000）

胃癌在我国各种恶性肿瘤中居首位，好发年龄在50岁以上，男女发病率之比为2: 1[1,2]。近年来发现，胃癌发病涉及多因素、多基因的参与[3-5]。钙离子作为第二信使，在多种细胞生命活动中发挥着重要的作用。钙周期素结合蛋白（calcyclin binding protein/Siah-1-interacting protein, CacyBP/SIP）能够促进结肠癌细胞[6]、慢性淋巴细胞白血病细胞[7]、胶质瘤细胞[8,9]和胰腺癌细胞[10]等多种肿瘤细胞增殖，由此提示CacyBP/SIP可能参与肿瘤的进展。CacyBP/SIP能促进胃癌细胞增殖和细胞周期运行[11]，并且CacyBP/SIP表达和胃癌患者预后负相关[12]，但其和胃癌侵袭转移的关系尚不明确。抑制基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）的表达可以抑制胃癌细胞侵袭转移[13]。AKT和ERK信号通路同样参与胃癌细胞侵袭转移，增强胃癌细胞AKT和ERK信号能促进胃癌细胞侵袭转移，相反抑制胃癌细胞AKT和ERK信号能抑制胃癌细胞侵袭转移[14,15]。因此，本研究主要通过探究胃癌组织以及癌旁组织中CacyBP/SIP的表达情况，检测在胃癌细胞株MKN-45中干扰及过表达CacyBP/SIP后对胃癌细胞迁移侵袭能力及MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-AKT表达水平的影响，以探索CacyBP/SIP影响胃癌侵袭转移的可能机制。

材料和方法

1 实验标本

随机数表法选取2014年1月1日至2015年1月1日在我院行肿瘤切除术的胃癌患者37例（平均年龄55.37±5.21岁），其中T分期T1期5例，T2期15例，T3期12例，T4期5例。所有患者术前3个月内未经过化疗和放疗。留取胃癌肿瘤组织和配对癌旁组织（距离癌灶组织边缘3cm）标本各37例，一部分组织制作石蜡切块，另一部分留存在-80℃冰箱保存。临床标本和临床资料的收集均征得患者或其家属同意并签署相关知情同意书。

2 细胞与试剂

人正常胃黏膜细胞GES-1细胞购自上海智宸辉生物技术有限公司；胃癌MGC-803、MKN-45、SGC-7901细胞株购自于中科院上海细胞库；胎牛血清、DMEM培养基购自杭州天杭生物公司；CacyBP/SIP抗体购自美国Santa公司；蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒、ERK1/2、p-ERK1/2、p-AKT、AKT、MMP-2、MMP-9、GAPDH抗体购于江苏碧云天生物有限公司；Western blot实验试剂盒套装购于广州赖德生物技术公司；免疫组织化学试剂盒购于北京中山金桥生物技术公司；CacyBP/SIP siRNA（si-CacyBP/SIP）与对照siRNA（si-NC）、腺病毒过表达CacyBP/SIP（Ad-CacyBP/SIP）和对照空载体（Ad-lacz）由广州伯信生物科技有限公司合成.

3 细胞培养与转染

人正常胃黏膜细胞GES-1细胞、胃癌细胞MGC-803、MKN-45、SGC-7901细胞分别培养于10%胎牛血清的DMEM培养基中，每2d换液1次，每周按照1:4传代。所有细胞培养48h后，Western blot检测细胞CacyBP/SIP表达。选择高表达的MKN-45细胞，进行细胞CacyBP/SIP siRNA（si-CacyBP/SIP）与对照siRNA（si-NC）、腺病毒过表达CacyBP/SIP（Ad-CacyBP/SIP）和对照空载体（lacz）转染。按照说明书方法进行转染：将1×106个/ml密度的MKN-45胃癌细胞接种于6孔板中，待细胞80%融合时，将si-CacyBP/SIP、si-NC、Ad-CacyBP/SIP或Ad-lacz转染至细胞，无血清培养基培养6h后，更换10%胎牛血清DMEM培养基继续培养24h，此细胞用于后续相关实验。

4 细胞分组

细胞分为control组（胃癌MKN-45细胞不进行处理）、si-CacyBP/SIP 组（转染CacyBP/SIP siRNA的胃癌MKN-45细胞）、si-NC组（转染对照siRNA的胃癌MKN-45细胞）、Ad-CacyBP/SIP组（转染Ad-CacyBP/SIP的胃癌MKN-45细胞）、lacz组（转染空载体的胃癌MKN-45细胞）。

5 细胞划痕实验

取各组细胞，按照1×106个/ml密度接种于6孔板中，待细胞完全铺满时，用10µl枪头垂直划一条竖线，用PBS冲洗细胞3次，倒置显微镜下拍照，标记为0h图片。然后，加入10%胎牛血清DMEM培养基继续培养24h，倒置显微镜下拍照，标记为24h图片。以0h图片为参考，利用Image J软件分析细胞相对迁移面积。细胞相对迁移率=实验组细胞迁移面积/对照组细胞迁移面积×100%。

6 Transwell细胞侵袭实验

Matrigel胶与无血清培养基按照8:1比例混匀，在24孔Transwell板中，每孔加入250μl混合液于Transwell小室上室中，风干，然后每孔加入100μl无血清培养基水化基底膜。调整细胞密度为2.5×105个/ml，取200μl加入小室内，下室内加入600μl含20% 胎牛血清的DMEM培养基，培养24h。弃去Transwell小室内液体，用棉棒轻轻擦除小室上室底部内面细胞，将小室侵入95%乙醇固定5min，加入4g/L结晶紫200μl染色10min。每个样品在倒置显微镜下随机选取6个视野，拍照并计数。细胞相对侵袭力=实验组侵袭细胞数量/对照组侵袭细胞数量×100%。

7 Western blotting

按照细胞蛋白提取试剂盒说明书萃取组织和细胞中蛋白，按照Western blot实验试剂盒套装说明书，每孔加入80µg蛋白量进行SDS-PAGE电泳。细胞电泳结束后，蛋白电转至PVDF膜，PVDF经5%脱脂奶粉封闭后，于摇床上室温孵育一抗（CacyBP/SIP，1:2000；ERK1/2，1:4000；p-ERK1/2，1:1000；p-AKT，1:1000；AKT，1:3000；MMP-2，1:2000；MMP-9，1:2000；GAPDH，1:8000）120min，TBST洗膜3×5min，孵育相应稀释比例二抗60min，TBST洗膜3×10min，用ECL化学发光显影，以GAPDH为内参，Image J软件分析相对条带灰度光密度值。

8 免疫组织化学染色

取胃癌组织石蜡切块，制作6µm厚度石蜡切片，68℃烤片5min，常规脱蜡至水，3%H2O2灭活10min，PBS洗2次；切片置0.01mol/L枸橼酸缓冲液95℃修复15min，PBS洗2次；羊血清37℃封闭20min；切片滴加一抗CacyBP/SIP（1:200）室温孵育90min，PBS洗3次；滴加生物素标记二抗（1:200），37℃孵育45min，PBS洗3次；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育45min，PBS洗3次； DAB染色，苏木素复染，常规脱水，透明，封片。依据文献[12]评分标准进行评分，阳性细胞染色频率＜5%，计0分；5%≤阳性细胞染色频率≤25%，计1分；5%＜阳性细胞染色频率≤50%，计2分；阳性细胞染色频率＞50%染色，计3分。计算各组免疫组织化学染色平均评分=（各组切片总评分）/各组例数。

9 统计学处理

计量结果均采用(均数±标准差)表示，所有研究数据的分析均采用软件SPSS 19.0进行统计，计量资料组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 不同T分期胃癌组织中CacyBP/SIP水平

免疫组织化学染色显示，胃癌组织CacyBP/SIP的蛋白表达平均积分随着T分期逐渐增高，其中T4期CacyBP/SIP蛋白免疫组织化学平均积分最高（图1A）。Western blot检测显示，胃癌组织中CacyBP/SIP表达水平明显高于癌旁组织，并随着T分期逐渐增高， T4期最高（图1B）。

2 MKN-45胃癌细胞系中CacyBP/SIP水平最高

Western blot结果显示，MGC-803、MKN-45和SGC-7901三种胃癌细胞系中CacyBP/SIP水平均高于人正常胃粘膜上皮细胞GES-1，以MKN-45细胞中水平最高（图2A）。故选择MKN-45细胞进行后续研究。在MKN-45细胞上转染si-CacyBP/SIP、si-NC、Ad-CacyBP/SIP或Ad-lacz后进行Western blot检测显示，si-CacyBP/SIP显著下调CacyBP/SIP水平，Ad-CacyBP/SIP显著上调CacyBP/SIP表水平，而si-NC与Ad-lacz不影响CacyBP/SIP水平（图2B）。

3 敲减和过表达CacyBP/SIP分别抑制和增强MKN-45细胞转移侵袭能力

细胞划痕实验显示，敲减CacyBP/SIP表达，MKN-45细胞的迁移能力明显减弱；过表达CacyBP/SIP，MKN-45细胞的迁移能力明显增强（图3A）。Transwell细胞侵袭实验显示，敲减CacyBP/SIP表达，MKN-45细胞的侵袭能力明显减弱，而过表达CacyBP/SIP，MKN-45细胞的侵袭能力明显增强（图3B）。

4 敲减和过表达CacyBP/SIP分别下调和上调MKN-45细胞内MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-AKT水平

Western blot分析显示，敲减CacyBP/SIP表达，MKN-45细胞的MMP-2和MMP-9水平显著降低，过表达CacyBP/SIP，MKN-45细胞的MMP-2和MMP-9水平显著增加（图4）。进一步Western blot检测发现，敲减CacyBP/SIP表达显著降低MKN-45细胞的p-ERK1/2和p-AKT水平，过表达CacyBP/SIP显著增加MKN-45细胞内p-ERK1/2和p-AKT水平（图5）。

讨 论

钙周期素结合蛋白（CacyBP/SIP）作为S100家族的靶蛋白之一，参与蛋白质泛素化-蛋白酶体降解途径[6,16]，在促进细胞周期的运行和抑制细胞凋亡信号转导中起重要作用[6-11]。最近的研究提示，CacyBP/SIP可能参与到胃癌的发生与发展过程[11,12]，但其与胃癌细胞侵袭迁移以及通过何种机制实现的研究尚不清楚。本研究中发现CacyBP/SIP在胃癌组织高表达，且随着T分期逐渐增加，在T4分期中表达最高。由此提示CacyBP/SIP表达与T分期正相关。胃癌T分期直接与胃癌细胞侵袭转移相关，因此，本研究进一步在胃癌细胞检测敲减或者过表达CacyBP/SIP后，胃癌细胞侵袭与转移的变化。本研究发现，相对于正常胃黏膜GES-1细胞，CacyBP/SIP表达在胃癌细胞高表达，其中在MKN-45细胞表达最高。因此，本研究选择MKN-45细胞，敲减CacyBP/SIP表达抑制细胞的侵袭转移和MMP-2、MMP-9表达；过表达CacyBP/SIP促进细胞侵袭转移和MMP-2、MMP-9表达。MMP-2和MMP-9是降解细胞外基质的关键酶[17]。细胞外基质和基底膜的降解是细胞侵袭转移的关键步骤[18]，抑制MMP-2和MMP-9的表达可以抑制胃癌细胞侵袭转移[15]，因此，CacyBP/SIP促进胃癌细胞侵袭转移，可能与CacyBP/SIP促进MMP-2、MMP-9表达相关。虽然，已有文献报道CacyBP/SIP能抑制胶质瘤细胞 U251和U87细胞侵袭与转移[19]，但CacyBP/SIP能促进成纤维NIH-3T3 细胞[20]和异位内膜间质ESCs细胞[21]转移，也能促进乳腺癌转移与复发[22]。这可能是CacyBP/SIP在不同的细胞内对侵袭转移的作用并不一致。

图1 不同T分期胃癌组织中CacyBP/SIP水平的免疫组织化学（A）和Western blot（B）检测。Con，癌旁组织；T1-T4，不同T分期；A1，代表性CacyBP/SIP免疫组织化学染色结果（比例尺=100µm）；A2，CacyBP/SIP免疫组织化学平均积分统计学分析；B1，代表性CacyBP/SIP Western blot检测结果；B2，CacyBP/SIP Western blot检测结果统计学分析；*，P＜0.01 vs ConFig. 1 Immunohistochemical (A) and Western blot examination for expression levels of CacyBP/SIP in the gastric cancer tissues at different T stages.Con, adjacent tissue; T1 to T4, different T stages; A1, representative results of CacyBP/SIP immunohistochemical staining (scale bar=100µm); A2,statistical analysis for mean scores of CacyBP/SIP immunohistochemical staining results; B1, representative results of CacyBP/SIP Western blotting;B2, statistical analysis for CacyBP/SIP Western blot results; *, P＜0.01 vs Con

图2 在胃癌细胞中CacyBP/SIP表达检测和转染效率鉴定。A，MGC-803、MKN-45和SGC-7901三种胃癌细胞系中CacyBP/SIP水平的Western blot检测（A1）及其统计学分析（A2）；B，MKN-45细胞中si-CacyBP/SIP和Ad-CacyBP/SIP转染效率的Western blot鉴定（B1）及其统计学分析（B2）；*，P＜0.01 vs GES-1细胞或control; n=3Fig. 2 Detection for expression level of CacyBP/SIP and identi fication of transfection efficiency in gastric cancer cell lines. A, Western blotting (A1) and its statistical analysis (A2) for level of CacyBP/SIP in 3 kinds of gastric cancer cell lines, namely MGC-803, MKN-45 and SGC-7901 cells; B, Western blotting (B1) and its statistical analysis (B2) for transfection efficiency of si-CacyBP/SIP and Ad-CacyBP/SIP in MKN-45 cells; *, P＜0.01 vs GES-1 cell line or control; n=3

图3 改变CacyBP/SIP表达水平对MKN-45细胞迁移侵袭能力的影响。A，细胞迁移能力划痕试验检测（A1）和统计学分析（A2）；B，细胞侵袭能力Transwell实验检测（B1）和统计学分析（B2）；*，P＜0.01 vs control group; n=3Fig. 3 Effect of changing CacyBP/SIP level on cell migration and invasion in MKN-45 cells. A, in vitro cell scratch assay (A1) and statistical analysis(A2) for cell migration; B, Transwell assay (B1) and statistical analysis (B2) for invasion; *, P＜0.01 vs control group; n=3

图4 改变CacyBP/SIP表达水平对MKN-45细胞内MMP-2和MMP-9水平的影响。A，MMP-2水平的代表性Western blot检测（A1）和统计学分析（A2）；B，MMP-9代表性Western blot检测（B1）和统计学分析（B2）；*，P＜0.01 vs control group; n=3Fig. 4 Effect of changing CacyBP/SIP expression on levels of MMP-2 and MMP-9 in MKN-45 cells. A, representative results of Western blotting (A1)and statistical analysis (A2) for MMP-2 level; B, representative results of Western blotting (B1) and statistical analysis (B2) for MMP-9 level; *, P＜0.01 vs control group; n=3

图5 改变CacyBP/SIP表达水平对MKN-45细胞内p-ERK1/2和p-AKT水平的影响。A，p-ERK1/2水平的代表性Western blot检测（A1）和统计学分析（A2）；B，p-AKT代表性Western blot检测（B1）和统计学分析（B2）；*，P＜0.01 vs control group; n=3Fig. 5 Effect of changing CacyBP/SIP expression on level of p-ERK1/2 and p-AKT in MKN-45 cells. A, representative results of Western blotting(A1) and statistical analysis (A2) for p-ERK1/2 level; B, representative results of Western blotting (B1) and statistical analysis (B2) for p-AKT level;*, P＜0.01 vs control group; n=3

CacyBP/SIP能直接结合ERK1/2[9,23]，并且能通过激活AKT信号促进胶质瘤U251细胞增殖[8]。ERK1/2和AKT磷酸化水平与胃癌细胞侵袭转移相关，比如抑制p-ERK1/2和p-AKT表达，胃癌细胞侵袭转移能力下降[14,15,24,25]，增强p-ERK1/2和p-AKT表达，胃癌细胞侵袭转移能力增强。本研究同样发现，敲减CacyBP/SIP表达抑制p-ERK1/2和p-AKT表达，过表达CacyBP/SIP促进细胞p-ERK1/2和p-AKT表达。由此提示，CacyBP/SIP促进胃癌细胞侵袭转移，可能与CacyBP/SIP激活ERK1/2、AKT信号活性相关。

综上所述，CacyBP/SIP与胃癌T分期正相关，且CacyBP/SIP促进胃癌MKN-45细胞侵袭转移能力，其作用可能与促进MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2、p-AKT蛋白表达相关，至于具体机制有待进一步研究。